УДК 612.82.015.3:615.322

КЛИНИКО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ НЕЙРОТРОПНОГО ДЕЙСТВИЯ ВОДНОГО ЭКСТРАКТА ТРУТОВОГО ГРИБА ЧАГИ

В течение 50 лет (с 50-х годов прошедшего столетия) в гастроэнтерологии и онкологии применяется водный экстракт трутового гриба чаги (Inonotus obliquus /Pers./ Pilat. f. sterilis). В качестве лекарственных средств из Inonotus obliquus в России и Белоруссии зарегистрированы сам гриб чага (включая плодовые тела и порошок из них) и препараты из него: “Бефунгин” (Befunginum) – водный экстракт, и “Гастрофунгин” - спиртовая настойка на 70%-ном этиловом спирте [8, 9]. В настоящее время их используют в гастроэнтерологии для лечения больных гастритами, при дискинезиях желудочно-кишечного тракта с явлениями атонии, при язве желудка и двенадцатиперстной кишки, а также в онкологической практике как симптоматическое и общетонизирующее средство [8, 9].

Известно, что водный экстракт чаги оказывает выраженное нейротропное (ноотропное) влияние: увеличивает объем кратковременной памяти, ускоряет процессы научения и пропускную способность зрительного анализатора, уменьшает длительность латентного периода и моторного времени сложной сенсомоторной реакции здоровых испытуемых [10, 11, 13]. Рядом исследователей [5, 9] установлено, что введение водного экстракта чаги животным вызывает у них (в частности, у кроликов) повышение температуры головного мозга, увеличение потребления кислорода, улучшение усвоения навязанного ритма возбуждения в коре больших полушарий, а также повышает их (в частности, мышей) устойчивость к гипоксии. Однако целенаправленного, комплексного изучения нейротропных эффектов трутового гриба чаги не проводилось. Особенности нейротропного действия водного экстракта чаги до сих пор остаются не выясненными. В связи с этим представляло научный и практический интерес изучение клинико-физиологических особенностей нейротропного действия водного экстракта чаги у человека и животных. Их выявление в условиях “in vitro” и “in vivo” и явилось целью нашего исследования.

Материалы и методы исследования. Исследования на людях проведены с участием 17-и больных язвой желудка или 12-перстной кишки мужского пола в возрасте от 22-х до 59-и лет при среднем возрасте в опытной группе 39,6 лет, а в контрольной группе — 35,3 года (разница не достоверна /p>0,05/). Диагноз язвенной болезни устанавливался на основании клинико-анамнестических данных и лабораторно-инструментальных методов исследования. При обследовании больных наряду с обязательными общеклиническими исследованиями проводились: фиброгастродуоденоскопия с биопсией, уреазный тест, исследование секреторной функции желудка. Обследование позволяло провести дифференциальную диагностику и исключить сопутствующие заболевания у пациентов, принятых в опытную и контрольную группы. Медикаментозная терапия проводилась согласно протокола лечения, утвержденного в 6-ой клинической больнице г. Минска для гастроэнтерологического отделения. Все больные контрольной и опытной группы получали блокатор гистаминовых Н_2-рецепторов 2-го поколения ранитидин (фирменное название препарата “Гистак”) в дозе по 0,15 г два раза в сутки утром и вечером в сочетании с антацидом алмолом (1 дозированная ложка х 4 раза в сутки). Больным опытной группы, кроме того, назначался бефунгин в дозе 4,5 мл в сутки при разведении теплой кипяченной водой до 100 мл; принимался внутрь в 3 приема (утром, в обед и вечером) за 30 минут до еды.

Нейротропная активность водного экстракта чаги (препарат “Бефунгин”) определялась по изменению показателей умственной работоспособности (высших интегративных функций мозга) больных людей, измеряемых с помощью комплекса приборов “ПФК-01”. Тестирование каждого больного проводили 4 раза: при поступлении, а также на 7-й, 14-й, 21-й дни лечения. Отдельные пациенты прошли последнее обследование на фоне амбулаторного приема препаратов. Всего проведено 76 комплексных исследований психофизиологических характеристик больных (из них 68 — в динамике). Каждое тестирование (комплексное исследование) включало в себя определение следующих показателей: объем кратковременной зрительной памяти на двузначные числа; внимание и пропускная способность зрительного анализатора (ПСЗА) в корректурном тесте с кольцами Ландольта; мышление по результатам решения простых арифметических примеров с однозначными числами; скорость и точность простой и сложной сенсомоторных реакций [2, 6, 7].

Опыты in vitro проведены на 7 срезах гиппокампа трех-четырех недельных крысят. Животных декапитировали, извлекали головной мозг и быстро помещали его в охлажденный до 3 ° С раствор искусственной цереброспинальной жидкости (ИЦЖ). После начала инкубации удаляли мозжечок и области мозга, прилежащие к гиппокампу. Толщина срезов гиппокампа не превышала 450 мкм. Срезы инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в растворе ИЦЖ, который насыщали карбогеном (95% O₂ и 5% CO₂). Установка для регистрации электрической активности нейронов гиппокампа [3, 4] состоит из: камеры, в которой в растворе ИЦЖ находится срез мозга (гиппокампа); системы перфузии, благодаря которой осуществляется смена растворов в камере; системы оксигенирования, насыщающей раствор карбогеном; системы терморегуляции, поддерживающей с помощью элемента Пельтье заданную температуру в камере; системы регистрации и электрической стимуляции.

Вызванные ответы регистрировали с помощью игольчатого платино-иридиевого микроэлектрода с размером неизолированной области около 50 мкм. Регистрирующий микроэлектрод размещался внеклеточно в слое stratum radiatum СА1, что позволяло проводить мониторинг постсинаптических потенциалов между телами нейронов и апикальными дендритами СА1 области. Внеклеточную стимуляцию подпороговыми импульсами осуществляли через монополярный платино-иридиевый микроэлектрод с размером неизолированной области около 100 мкм. Поскольку стимуляция осуществлялась подпороговыми импульсами, то основной вклад в формирование вызванных ответов вносил полевой возбуждающий постсинаптический потенциал (пВПСП). Стимулирующий микроэлектрод размещали в слое stratum rаdiatum на границе областей СА1- СА3. Такое расположение позволяло локально активировать коллатерали Шаффера. С целью нивелирования передачи по коллатералям Шаффера ритмической активности от гигантских пирамидных нейронов СА3 области предварительно осуществляли рассечение ткани мозга на границе областей СА1- СА3. Каждый стимулирующий импульс включал отрицательную и положительную фазы (амплитудой 50 мкА и длительностью 300 мкс). Обычно в исходном состоянии наносили 10- 50 парных стимулов, с межстимульным интервалом в 50 мс и интервалом между парой стимулов в 3 с. Затем на фоне продолжающейся стимуляции, начинали перфузию экстракта трутовых грибов (раствор чаги от 10 мкг/мл до 1000 мкг/мл).

За три недели до эксперимента всех крыс адаптировали к экспериментальным условиям (хендлинг в течение двух-трех дней, затем 9–10 тренировок по 2–4 ч в специальных боксах, в которых животные могли совершать движения вокруг оси и небольшие в ростро-каудальном направлении) [1, 15]. Для нивелирования возможных влияний циркадианных ритмов на регистрируемые показатели наблюдения осуществляли в фиксированное время (9.30–12.00 утра). Регистрацию физиологических показателей у животных проводили в термостатах при температуре 29.9 ^oС (термонейтральные условия для крыс [15]).

Соматический ноцицептивный рефлекс оценивали по величине латентного периода реакции отдергивания хвоста крыс в ответ на термический ноцицептивный стимул (погружение хвоста в воду (49° С) на две трети его длины). Для оценки глубокой температуры тела через анальное отверстие на глубину 9–10 см в толстую кишку вводили термопару (электротермометр фирмы “Physitemp”, США). Уровень артериального давления регистрировали “манжеточным” способом в регионе хвостовой артерии. Для этого сравнивалось изменение оптической плотности поверхностных тканей хвоста в инфракрасных лучах до и после пережатия хвостовой артерии с помощью пневмоманжеты, соединенной с датчиком давления. В качестве излучателя использовали инфракрасный светодиод АЛ-107, в качестве фотоприемника – фотодиод ФД-256 (Беларусь). Измерения РОХ и Ад регистрировали трижды.

Статистическую обработку данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента и программы вариационной статистики ANOVA. Различия считали значимыми при Р< 0.05. На рисунках и в тексте результаты представлены в виде M± m.

Результаты и их обсуждение. Исследования на людях показали, что через 2 недели от начала приема бефунгина у больных при 3-ем и 4-ом тестированиях было зарегистрировано повышение умственной деятельности: уменьшалось число ошибок (на 2 - 4 единицы; р< 0,05) в тестах “простая и сложная сенсомоторные реакции”; увеличивался объем кратковременной зрительной памяти на двузначные числа (на 12,5 - 17,5%, р< 0,02); улучшалось внимание за счет снижения числа ошибок (на 3,6 - 4,1 %, р< 0,05) и увеличения количества прокорректированных колец Ландольта. Это свидетельствовало об улучшении пропускной способности зрительного анализатора на 0,11 - 0,16 бит/с (р< 0,02) у пациентов опытной группы. У больных контрольной группы вышеперечисленные показатели умственной работоспособности (УР) в динамике лечения по сравнению с исходным уровнем не изменялись или даже повышались. Сумма ошибок по всем использованным тестам наиболее полно характеризует качество умственной работы. По этому показателю нами также была выявлена положительная динамика у больных опытной группы: снижалось общее число ошибок как по отношению к исходному уровню, так и к аналогичному показателю пациентов из контрольной группы, не получавших водный экстракт чаги (рис. 1).

Рис. 1.

Динамика умственной работо-способности больных (по изменению суммы ошибок [D е СО] к исходному ее значению) в опытной и контрольной группах.

Пояснения:

1. — различия достоверны по отношению к исходному уровню (p< 0,02);

2. — различия достоверны по отношению к контролю (p< 0,05);

3. n — число больных в группе.

Анализируя результаты исследований высших интегративных функций мозга (ВИФМ) больных людей необходимо включить в сферу своего внимания препараты протокола лечения, на фоне которых проявлял свое стимулирующее действие бефунгин. Как уже указывалось, протокол включал в себя препарат “Гистак”, который мог оказать [2, 8] — и оказал — системное действие на организм пациентов.

В наших исследованиях мы выявили у части больных выраженное влияние гистака на ВИФМ. Так, анализируя динамику психофизиологических показателей больных контрольной группы, мы выявили 2 подгруппы. Показатели УР по сумме ошибок, нарастая в одной подгруппе и снижаясь в другой, к 4-ому исследованию (21-му дню приема препаратов протокола лечения) достигают достоверной разницы, т.е. у части пациентов УР еще снижается, несмотря на позитивную динамику эндоскопической картины. Эти результаты согласуются с имеющимися в литературе [2, 8, 9] многочисленными данными о проявлении побочного действия Н₂-гистаминовых блокаторов. Известно, что препараты этой группы широко назначаются больным для длительного многонедельного приема. Так, по данным Катцунга (1998), количество продаж Н₂-гистаминовых блокаторов в мире по сравнению с лекарствами других групп стоит на 1-ом месте и сумма от их реализации достигла 4-х миллиардов долларов США в год. Учитывая побочные эффекты действия этих препаратов в виде угнетения внимания, памяти и других показателей УР, вероятно, необходимо их контролировать соответствующими методиками, так как, например, в наших исследованиях побочные эффекты гистака субъективно и на клиническом уровне не проявлялись. Особенно, актуальным контроль УР становится в условиях амбулаторного лечения пациентов Н₂-гистаминовыми блокаторами, которое практикуется шире с каждым годом. Нередко это касается пациентов, специфика труда которых требует высокого уровня всех аспектов УР при длительной и напряженной деятельности. Помимо контроля над указанными аспектами состояния пациентов, представляется целесообразным применение в протоколе лечения препаратов, коррегирующих побочное действие Н₂-гистаминовых блокаторов на ВИФМ.

Рис. 2.

Особенности возбуждающих постсинаптических потенциалов в СА1 области гиппокампа при парной стимуляции коллатералей Шаффера в условиях перфузии срезов гиппокампа раствором чаги (1000 мкг/мл).

Обозначения: По вертикали представлены искусственно выбранные единицы, полученные в результате нормирования амплитуды вызванных ответов в условиях перфузии срезов раствором чаги на амплитуду ответов в исходном состоянии. По горизонтали представлено время наблюдения в секундах

Водный экстракт чаги (в виде препарата “Бефунгин”), разрешенный к применению в гастроэнтерологии и применяющийся в составе схем лечения язвы желудка и/или 12-перстной кишки, обладает достаточно стойким стимулирующим действием на УР и может быть рекомендован для более широкого использования в том числе в качестве средства для коррекции побочных (седативных) эффектов блокаторов Н₂-гистаминовых рецепторов.

Учитывая важную роль нейронов гиппокампа [14] в механизмах памяти, внимания и реализации других ВИФМ в опытах in vitro изучалось влияние водного экстракта чаги на электрическую активность изолированных структур гиппокампа крыс. Как видно из графика, представлено на рис. 2, через 40-45 с после начала перфузии срезов гиппокампа раствором чаги в концентрации 1000 мкг/мл происходит небольшое увеличение амплитуды ВПСП в ответ на оба парных стимула. Начиная со второй минуты перфузии (см. рис. 2, рис 3), амплитуда ВПСП в ответ на парную стимуляцию коллатералей Шаффера начинает прогрессивно уменьшаться. Снижение амплитуды продолжается в течение двух-десяти мин даже после прекращения перфузии срезов раствором чаги (во всех экспериментах продолжительность перфузии составляла три минуты).

Рис. 3.

Изменение амплитуды полевых возбуждающих постсинаптических потенциалов при действии чаги в концентрации 1000 мкг/мл. А - до

перфузии раствора чаги, Б – на 180 с перфузии раствора чаги.

При уменьшении концентрации раствора чаги до 10-100 мкг/мл выявляется картина лишь прогрессивного уменьшения амплитуды ВПСП. Так, как представлено на рис. 4, снижение амплитуды ВПСП в ответ на парную стимуляцию коллатералей Шаффера отмечалось на протяжении всего периода перфузии срезов гиппокампа раствором чаги в концентрации 100 мкг/мл. Полученные в опытах in vitro результаты подтверждают ранее высказанное предположение [9, 12] о наличии выраженных нейротропных эффектов экстрактов этого трутового гриба. Поскольку доминирующим эффектом в модельных экспериментах на срезах гиппокампа было создание условий на пре- и постсинаптическом уровне, затрудняющих формирование ВПСП, то можно заключить о несомненном модулирующем влиянии водных экстрактов чаги на синаптические процессы на уровне гиппокампа.

Рис. 4.

Особенности возбуждающих постсинаптических потенциалов в СА1 области гиппокампа при парной стимуляции коллатералей Шаффера в условиях перфузии срезов гиппокампа раствором чаги (100 мкг/мл).

Обозначения: По вертикали представлены искусственно выбранные единицы, полученные в результате нормирования амплитуды вызванных ответов в условиях перфузии срезов раствором чаги на амплитуду ответов в исходном состоянии. По горизонтали представлено время наблюдения в секундах

Затруднение формирования ВПСП в stratum radiatum области CA1 гиппокампа, вызываемое экстрактом чаги, может способствовать тому, что в его активности будут преобладать более медленные электрические ритмы (тета-ритм). Тета-ритм [14] отражает участие структур гиппокампа в ориентировочном рефлексе, реакциях настораживания, повышения внимания, процессах памяти, в динамике обучения. Результаты этих исследований “in vitro” согласуются с данными об улучшении под влиянием чаги усвоения навязанного ритма возбуждения нейронами новой коры [5] и их реципроктных отношениях с электрической ритмикой гиппокампа [14]; о предупреждении или ослаблении угнетения поведенческой активности (ориентировочного рефлекса) у подвергнутых иммобилизационному стрессу животных [9, 12]; о повышении внимания (пропускной способности зрительного анализатора) и умственной работоспособности здорового [10, 11, 13] и больного (рис. 1) человека в динамике обучения (повторных тестирований). Полученные данные дают основание полагать, что в повышении внимания, увеличении объема кратковременной и усилении процессов долговременной памяти в условиях применения водных экстрактов чаги важная роль может принадлежать их модулирующему влиянию на синаптические процессы на уровне гиппокампа.

В хронических экспериментах на белых крысах самцах (n=12) показано, что между исходными измерениями функциональных показателей и данными, полученными на седьмые сутки исследования, изменений уровня артериального давления и глубокой температуры тела не обнаружено. В отношении латентного периода рефлекса отдергивания хвоста крыс выявлено его снижение на 7-е сутки наблюдения у группы животных, получавших водный раствор чаги по сравнению с группой крыс, которым в питьевую воду экстракт трутовых грибов не добавлялся. В частности, длительность РОХ в группе крыс, получавших раствор чаги, составляла 3.7?0.2 с /р<0,02/, а в группе контрольных животных – 5.3?0.5 с. Уменьшение латентного периода РОХ позволяет судить об активирующим влиянии экстракта трутового гриба чаги на процессы, протекающие в ЦНС крыс и осуществляющие контроль защитных механизмов организма. Уменьшение под влиянием чаги длительности латентных периодов (но уже сложной сенсомоторной реакции) выявлено нами [11-13] и в исследовании на людях. Наблюдаемое повышение активности нейронов сопровождается увеличением потребления мозгом кислорода и его температуры [5, 9]. В тоже время более раннее и более адекватное включение защитных механизмов приводит к выраженному стресспротекторному, в том числе и антигипоксическому, действию экстрактов чаги [9]. Важная роль в этом может принадлежать структурам гиппокампа, выраженное модулирующее действие на которые оказывает водный экстракт чаги.

Особый интерес представляют данные о двухфазном влиянии больших концентраций водных экстрактов чаги (1 мг/мл или 1000 мкг/мл) на формирование ВПСП (сначала увеличение, а затем угнетение). Можно предполагать, что гипералгезивный эффект чаги по уменьшению длительности РОХ сопряжен с угнетением возможности формирования ВПСП в структурах гиппокампа, в то время как 1-я фаза действия чаги (увеличение амплитуды ВПСП) может сопровождаться гипоалгезией. Это наблюдают в клинике [8, 11], назначая гастроэнтерологическим и онкологическим больным водные экстракты чаги в больших дозах до 1-3 стаканов настоя в день (2500 – 7500 мг/сутки).

Таким образом, полученные данные подтверждают имеющиеся в научной литературе сведения о способности водных экстрактов чаги оказывать выраженное нейротропное действие и дают основание говорить о возможности участия в этом процессе структур гиппокампа, а также зависимости их активности от воздействующей концентрации экстрагированных веществ применяемого препарата.

1. Антипенко А. А., Песоцкая Я. А // Проблемы интеграции функций в физиологии и медицине (к 100-летнему юбилею присуждения Нобелевской премии академикуИ. П.Павлову): сб. статей под ред. В. Н. Гурина и К. В. Судакова.– Минск. 2004.– С. 32– 33..
2. Бертрам К. Катцунг Базисная и клиническая фармакология: в 2 томах. Т. 1. И Т. 2. – М.– Пб.: Бином - Невский Диалект, 1998.
3. Гаркун Ю. С., Денисов А. А., Черенкевич С. Н., Молчанов П. Г., Кульчицкий В. А. // Новости медико-биол. наук. – 2004. - № 3. – С. 92 – 95.
4. Гаркун Ю. С., Денисов А. А., Черенкевич С. Н., Молчанов П. Г., Кульчицкий В. А. // Новости медико-биол. наук. – 2004. - № 4. – С. 70 – 72.
5. Еременко М.В. //Высшие грибы и их физиологически активные соединения / Под ред. проф. А.А.Федорова.— Л.: Наука, 1973.— С. 54-59.
6. Загрядский В.П., Сулимо-Самуйлло Э.К. Методы исследования в физиологии труда.- Л.: ЛВМедА, 1991.- 110 с.
7. Матвеев Е.В., Надеждин Д.С., Зуев Л.Н., Васильев А.А. //Медицинская техника. — 1996.— № 1.— С. 46-47.
8. Машковский М.Д. Лекарственные средства: В 2 т. Т. 1. и Т.2.— 14-е изд., перераб., испр. и доп.— М.: ООО “Издательство Новая Волна”, 2000.— Т.1, 540 с.– С. 134–136; Т.2, 608 с. – С. 180.
9. Переверзев В.А. Фунгоадаптогены: источники получения, биологическая активность, механизмы действия, перспективы применения.– Мн.: БГМУ, 2003.– 90 с.
10. Переверзева Е.В. //Молодежь третьего тысячелетия: гуманитарные проблемы и пути их решения: Сб. научных статей в 3-х томах. Общий сост. и науч. ред. проф. В.Н. Соколов.— Одесса: ИСЦ, 2000.— Том. II.— С. 471-479.
11. Переверзева Е.В. //Труды молодых ученых. Под общ. ред. проф. С.Л.Кабака.— Мн.: МГМИ, 2001.— С. 116 - 122.
12. Переверзева Е.В. Состояние поведенческой активности животных и умственной работоспособности человека в условиях влияния экстрактов трутовых грибов и растений семейства аралиевых // Авт. дис. на соиск. уч. ст-ни к. м. н.— Минск, 2002. — 22 с.
13. Переверзева Е.В., Переверзев В.А. // Вестник Смоленской медицинской академии. Медико-биологический журнал.– 1999.– № 4.– С. 113 – 114.
14. Циркин В.И., Трухина С.И. Физиологические основы психической деятельности и поведения человека. – М.: Медицинская книга, Н.Новгород: Изд-во НГМА, 2001. – 522 с. – С. 141 – 142.
15. Koulchitsky S.V., Levkovets V.S., Tchitchkan D.N., Soltanov V.V., Kulchitsky V.A. // Life Sciеnces.– 1999.– Vol. 64., № 3-4.– P. 37–43.

Е.V. Pereverzeva¹, s.v. Shimanets¹, A.A. Antipenko², Yu.S.Garkun², L.E. Roznova², А. Awad¹, S.G. Pashkenich², T.S. Kandibo², V.A. Pereverzev¹, V.A. Kulchitsky²