http://www.smolensk.ru/user/sgma/MMORPH/N-16-html/cont.htm

УДК 616.155.3.-008.13-073.537.9

ОСОБЕННОСТИ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ЦЕЛЬНОЙ РАЗВЕДЕННОЙ КРОВИ

(leonov.doc)

Ó 2007 г. Федоров Г. Н., Леонов С. Д.

Хемилюминесцентный анализ является основным в оценке функциональной активности фагоцитов. Целью нашей работы явилось изучение кинетики спонтанной и стимулированной люминолзависимой хемилюминесценции (ЛХЛ) цельной разведенной крови. При анализе кинетики стимулированной ЛХЛ мы зафиксировали два максимума. Второй пик стимулированной ЛХЛ обусловлен эндогенной активацией,резервных (зимозан-неактивных) нейтрофилов. Это позволяет предположить, что в периферической крови имеются два пула нейтрофилов – это зимозан-активные и зимозан-неактивные (незрелые).

Ключевые слова:хемолюминесценция,нейтрофилы.

Хемилюминесцентный анализ является основным в оценке функциональной активности фагоцитов, поскольку имеет преимущества по сравнению с полярографией, реакцией восстановления нитросинего тетразолия, методом определения кислородных метаболитов и т.д. Особенно важен метод для оценки клеточного звена естественного иммунитета.

Для скрининга больных с дефектами фагоцитарного звена используют микрометод анализа хемилюминесценции (ХЛ) в цельной крови, в которой в отличие от чистой взвеси нейтрофилов, присутствуют эритроциты, моноциты и тромбоциты, не вносящие при соответствующем разведении существенного вклада в конечный показатель ХЛ, как было доказано ранее.[1]

Имеются прямые доказательства, что усиленная генерация кислородных радикалов в фагоцитах (респираторный взрыв) при их активации и вызванная ими ХЛ коррелируют с поглощением и киллингом объектов фагоцитоза [1].

При ХЛ фагоцитов, наблюдается образование клетками активных форм кислорода (АФК), включая супероксидный анион, гидроксил, синглетный кислород, гипохлорид [1, 2].

По методике, предложенной Земсковым В.М. (1988) в модификации Аверченкова В.М. (2001), измерение стимулированной люминолзависимой хемилюминесценции (ЛХЛ) цельной разведенной крови проводится в течении 30 минут. Анализу подлежит время появления максимума ХЛ (респираторного взрыва) и количество импульсов генерируемых одной клеткой (нейтрофильным гранулоцитом периферической крови), поглотившей зимозан, за 1 минуту (импульс/клетка за минуту)[3].

Выбор продолжительности регистрации ЛХЛ не случаен, т.к. между моментом связывания объекта фагоцитоза и началом образование активных радикалов имеется лаг-период 16-60 секунд и более в зависимости от вида стимулятора. Скорость образования радикалов начинает снижаться через 20-30 минут после старта активации и через 60 минут становится в несколько раз ниже начальной скорости. Причем, путем вторичной стимуляции респираторный взрыв получить не удавалось [2].

Важно отметить, что респираторный взрыв и образование активных радикалов не сопровождался стимуляцией белоксинтетической функции клетки, так как в активированных нейтрофилах отсутствует эндоплазматическая сеть, что определяет их неспособность синтезировать белок. Поэтому респираторный взрыв может быть спровоцирован в этой клетке однократно, так как при повторной стимуляции пика ХЛ не наблюдался. Более того, ингибирование синтеза РНК не отраждалось на поглощении объектов фагоцитоза, интенсивности респираторного взрыва, микробицидности и цитотоксичности.

Однако показано, что ЛХЛ цельной крови можно наблюдать в течении 10-12 часов, причем при её разведении физиологическим раствором или раствором Хенкса интенсивность ХЛ увеличивалась [7].

Целью нашей работы явилось изучение кинетики спонтанной и стимулированной ЛХЛ цельной разведенной крови.

Материалы и методы. Исследовали 20 практически здоровых доноров в возрасте от 5 до 25 лет. Кровь в стерильных условиях забирали из локтевой вены утром натощак в центрифужную пробирку с гепарином (5 ЕД/мл) и проводили анализ ЛХЛ. В силиконизированную кювету для сцинтилляционного счета к 200 мкл разведенной гепаринизированной целенной крови (80 мкл в 600 мкл полного раствора Хенкса без красителей) добавляли 100 мкл люминола (5,6 · 10 ^-4М) и 100 мкл зимозана (20 мг/мл) для изучения стимулированной ЛХЛ. Для регистрации спонтанной ЛХЛ зимозан в систему не вносили. Стимулированную и спонтанную ЛХЛ регистрировали в течении 14 часов каждые 30 секунд одновременно в разных кюветах у одного и того же донора. Температура инкубации составляла 37°С.

Оценивали время появления пика и интенсивность его ХЛ (выражали в условных единицах), для чего из регистрируемого значения интенсивности светосуммы максимума ХЛ вычитали фоновое свечение хемилюминометра.

Результаты исследования. При анализе кинетики стимулированной ЛХЛ зафиксировали два максимума. Первый пик на на 33±2,2 минуте интенсивностью 2189±332 у.е, а второй пик, в среднем на 115±1,8 минуте - 1255±222 у.е.

В ходе регистрации кинетики спонтанной ЛХЛ цельной крови на 103±2,3 минуте выявлялся максимум ХЛ, интенсивностью 2049±193,8 у.е. Причем пика на 30-й минуте в данных условиях не наблюдалось.

По данным Герасимова и соавт. [4] при икубации цельной крови при 37°С с гепарином в течении 5 часов происходила активация наибольшего количества нейтрофилов в реакции восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) спустя 2,5 часа. При этом доля активированных нейтрофилов (ДАН) возрастала в 1,79±0,17 раза по сравнению с реакцией проведенной спустя 0,5 часов после предварительного термостатирования крови.

Также показано, что при свертывании крови, которое происходит несмотря на наличие антикоагулянта в процессе инкубации при 37°С, образуются биологически активные вещества, ответственные за стимуляцию нейтрофилов и повышенному производству активных форм кислорода (АФК). [4]

Одним из таких веществ является фибриноген – белок острой фазы воспаления, который участвует в свертывании крови [2]. Жамбалова и соавт. [5] показали, что фибриноген усиливал интенсивность ЛХЛ нейтрофилов периферической крови, кроме того, при воспалении повышается концентрация фактора активации тромбоцитов (ФАТ), который вырабатывается активированными нейтрофилами и макрофагами и пара-аутокринно ФАТ индуцирует в них направленную локомоцию, секрецию лизосомальных ферментов, усиление метаболизма и генерацию активных форм кислорода. [6]

Таким образом, не зависимо от наличия в хемилюминесцентной системе зимозана после 100-й минуты инкубации происходило стимулирование нейтрофилов к респираторному взрыву, что соответствует данным литературы.

Мы выявили, что величина воторого пика при стимулированной ЛХЛ достоверно меньше, чем при спонтанной. Следовательно, в период максимума спонтанной ЛХЛ активируются нейтрофилы, которые могут выделять АФК при контакте с зимозаном, так и дополнительные клетки, простимулированные эндогенными биологически активными веществами.

Исходя из вышеизложенного, можно предположить, что второй пик стимулированной ХЛ обусловлен эндогенной активацией, резервных (зимозан неактивных) нейтрофилов. Это позволяет предположить, что в периферической крови имеются два пула нейтрофилов – это зимозан-активные и зимозан-неактивные (незрелые), которые способны активироваться под пара-аутокринным воздействием эндогенных факторов.

В месте с тем на выделение АФК нейтрофилами могут влиять различные факторы. Конкретный механизм стимуляции кислородного взрыва пока до конца не понятен. Выявленные нами дополнительные пики ХЛ требуют дальнейшего изучения.

ЛИТЕРАТУРА

1. Земсков В.М. Хемилюминесценция крови. Методические рекомендации. 1988.

2. Воспаление. Руководство для врачей/ Под редакцией В.В. Серова, В.С. Паукова. – М.: Медицина, 1995 . – 640 с.

3. Аверченков В.М. Комплексная оценка эффективности локальной и системной иммунокоррекции миелопидом у больных с вторичной иммунной недостаточностью // Дис. канд. мед. наук. Смоленск. – 2001. – 134 с.

4. Герасимов И.Г., Игнатов Д.Ю. Свертывание крови активирует нейтрофилы к респираторному взрыву // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.- №7.- 2005.- с.88-90.

5. Жамбалова Б.А., Азизова О.А., Лопухин Ю.М. Влияние фибриногена на функциональную активность лейкоцитов крови // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.- №5.- 2002.- с.519-521

6. Зинченко В.П., Мысякин Е.Б., Долгачев В.А. Действие структурных аналогов фактора активации тромбоцитов на передачу внутриклеточных сигналов в перитонеальных нейтрофилах мыши и макрофагах линии Р388Д1 // Биофизика.- №5.- 1997.- с.1097-1105

7. Воейков В.А., Новиков К.Н. Низкоинтенсивная хемилюминесценция цельной крови человека отражает её своичства как кооперативной биологической системы // II съезд биофизиков России. Тезисы. М. 1999.

CHEMILUMINESCENCE FROM WHOLE DILUTED BLOOD

Leonov S. D., Fedorov G. N.

Chemiluminescence analysis is the main procedure in the estimation of phagocytes functional activity. The purpose of our research work was studying the kinetics of spontaneous and luminol-dependent chemiluminescence from whole diluted blood. During the analysis of enhanced luminol-dependent chemiluminescence two maxima have been fixed. The second peak of enhanced luminol-dependent chemiluminescence is caused by endogenous activation of reserve (zymosan-passive) neutrophils. It can be that in peripheral blood there are two pools of neutrophils which are zymosan-active and zymosan-passive (immature).

Key words: chemiluminescence, neutrophils.

Центральная научно-исследовательская лаборатория

Смоленская государственная медицинская академия

Поступила в редакцию 15.10.2007.