УДК 546.212:576.7

ГЕОМЕТРИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО ТКАНЕВОГО ПРОСТРАНСТВА

© 1997 г. В. А. Глотов

I

ИЗМЕНЕНИЯ ГЕОМЕТРИИ МАКРО-МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ПРОСТРАНСТВА В ИЗОЛИРОВАННЫХ ИЗ ОРГАНИЗМА АНАТОМИЧЕСКИХ ОБРАЗОВАНИЯХ ПРИ ФИКСАЦИИ В ЭТИЛОВОМ СПИРТЕ, АЦЕТОНЕ, ФОРМАЛИНЕ

Экспериментально-морфологический этюд

СОДЕРЖАНИЕ

Вступление

1. Предварительные опыты

1. Изменение массы изолированного из организма кусочка головного мозга в процессе фиксации в этиловом спирте (96°), ацетоне (конц.), формалине (40%)

а) Опыты №1-№5

б) Сводная таблица к опытам №1-№5

в) Сводный график к опытам №1-№5

2) Изменение объема изолированного из организма кусочка головного мозга в процессе фиксации в этиловом спирте (96°), ацетоне (конц.), формалине (40%)

а) Опыты №6-9

б) Сводная таблица к опытам №6-№9

в) Сводный график к опытам №6-№9

3) Интерпретация опытов №1-№9

2. Гипотеза "- объема" и ее экспериментальная проверка

1. Гипотеза "- объема"

2) Экспериментальная проверка гипотезы "- объема" при фиксации кусочков головного мозга в этиловом спирте (96°), ацетоне (конц.), формалине (40%)

а) Система для фиксации

б) Модельные опыты и их интерпретация

в) Опыты №10-№17

г) Сводная таблица опытов №10-№17

д) Графики к опытам №10-№17

е) Интерпретация опытов №10-№17

3) Элементарная геометрическая модель фиксации

Заключительные выводы. Литература

ВСТУПЛЕНИЕ

Рассмотрим некоторые физико-химические и геометрические аспекты процесса фиксации на примере фиксации изолированных из организма кусочков головного мозга в этиловом спирте (96°), ацетоне (конц.), формалине (40%).

1. Предварительные опыты

1) Изменение массы изолированного из организма кусочка головного мозга в процессе фиксации в этиловом спирте (96°), ацетоне (конц.), формалине (40%)

а) Опыты №1-№5

Опыт №1. Кусочек головного мозга размерами приблизительно 1х1х1 (см), массой 1250 мг, изолирован из мозга мужчины 37 лет через 14 часов с момента наступления внезапной смерти и заморожен. Через 52 часа с момента наступления смерти кусочек мозга разморожен и его температура доведена до комнатной. При осмотре через микроскоп МБС-1: кусочек мозга бледно-розового цвета, желеобразной мягко-эластической консистенции, с гладкой глянцевой поверхностью, с четкой границей между серым и белым веществом. Фиксация проводилась при температуре 19°С в 100 мл этилового спирта (96°). Через каждые 10 минут в течение 2-х часов кусочек извлекался из фиксатора, обсушивался и взвешивался, затем вновь погружался в фиксатор.

Опыт №2. Кусочек головного мозга размерами приблизительно 1.5х1х0.5 (см), массой 1490 мг, изолирован из мозга мужчины 53 лет через 20 часов с момента наступления внезапной смерти. При осмотре через микроскоп МБС-1: кусочек мозга бледно-розового цвета, желеобразной мягко-эластической консистенции, с гладкой глянцевой поверхностью, с четкой границей между серым и белым веществом. Фиксация проводилась при температуре 21°С в 100 мл этилового спирта (96°). Через каждые 10 минут в течение 2-х часов кусочек извлекался из фиксатора, обсушивался и взвешивался, затем вновь погружался в фиксатор.

Опыт №3. Кусочек головного мозга размерами приблизительно 1.5х1х0.5 (см), массой 1730 мг, изолирован из мозга мужчины 49 лет через 30 часов с момента наступления внезапной смерти и заморожен. Через 52 часа с момента наступления смерти кусочек мозга разморожен и его температура доведена до комнатной. При осмотре через микроскоп МБС-1: кусочек мозга бледно-розового цвета, желеобразной мягко-эластической консистенции, с гладкой глянцевой поверхностью, с четкой границей между серым и белым веществом. Фиксация проводилась при температуре 24°С в 100 мл этилового спирта (96°). Через каждые 10 минут в течение 5-ти часов, затем через 29, 53 и 75 часов, кусочек извлекался из фиксатора, обсушивался и взвешивался, затем вновь погружался в фиксатор.

Опыт №4. Кусочек головного мозга размерами приблизительно 1.5х1х0.5 (см), массой 1600 мг, изолирован из мозга мужчины 49 лет через 30 часов с момента наступления внезапной смерти и заморожен. Через 70 часов с момента наступления смерти кусочек мозга разморожен и его температура доведена до комнатной. При осмотре через микроскоп МБС-1: кусочек мозга бледно-розового цвета, желеобразной мягко-эластической консистенции, с гладкой глянцевой поверхностью, с четкой границей между серым и белым веществом. Фиксация проводилась при температуре 23.5°С в 100 мл формалина (40%). Через каждые 10 минут в течение 2-х часов, затем через 17 и 22 часа кусочек извлекался из фиксатора, обсушивался и взвешивался, затем вновь погружался в фиксатор.

Опыт №5. Кусочек головного мозга размерами приблизительно 1.5х1х0.5 (см), массой 1630 мг, изолирован из мозга мужчины 49 лет через 30 часов с момента наступления внезапной смерти и заморожен. Через 134 часа с момента наступления смерти кусочек мозга разморожен и его температура доведена до комнатной. При осмотре через микроскоп МБС-1: кусочек мозга бледно-розового цвета, желеобразной мягко-эластической консистенции, с гладкой глянцевой поверхностью, с четкой границей между серым и белым веществом. Фиксация проводилась при температуре 24°С в 100 мл ацетона (конц.). Через каждые 10 минут в течение 2-х часов кусочек извлекался из фиксатора, обсушивался и взвешивался, затем вновь погружался в фиксатор.

б) Сводная таблица к опытам №1-№5

Таблица 1

б) Сводный график к опытам №1-№5

2) Изменение объема изолированного из организма кусочка головного мозга в процессе фиксации в этиловом спирте (96°), ацетоне (конц.), формалине (40%)

а) Опыты №6-9

Опыт №6 (проводился параллельно с опытом № 3). Кусочек головного мозга (тот же самый, что и в опыте №3) через каждые 30-40 минут в течение 5 часов, затем через 53 и 75 часов, извлекался из фиксатора, обсушивался и погружался для измерения объема в центрифужную пробирку со шкалой (цена деления 0.2 см³) в изолированную от того же трупа плазму. Затем кусочек обсушивался и вновь погружался в фиксатор (этиловый спирт). Начальный объем кусочка в плазме 1.7 см³.

Опыт №7. Кусочек головного мозга размерами приблизительно 1.5х1х0.5 (см), объемом 1.5 см³, изолирован из мозга мужчины 49 лет через 30 часов с момента наступления внезапной смерти и заморожен. Через 70 часов с момента наступления смерти кусочек мозга разморожен и его температура доведена до комнатной. При осмотре через микроскоп МБС-1: кусочек мозга бледно-розового цвета, желеобразной мягко-эластической консистенции, с гладкой глянцевой поверхностью, с четкой границей между серым и белым веществом. Фиксация проводилась при температуре 23.5°С в 100 мл этилового спирта (96°). Через каждые 10 минут в течение 2-х часов, затем через 26 часов, кусочек извлекался из фиксатора, обсушивался и погружался для измерения объема в центрифужную пробирку со шкалой (цена деления 0.2 см³) в изолированную от того же трупа плазму. Затем кусочек обсушивался и вновь погружался в фиксатор

Опыт №8 (проводился параллельно с опытом №4. Кусочек головного мозга (тот же самый, что и в опыте №4) через каждые 30 минут в течение 2-х часов, затем через 70 часов, извлекался из фиксатора, обсушивался и погружался для измерения объема в центрифужную пробирку со шкалой (цена деления 0.2 см³) в изолированную от того же трупа плазму. Затем кусочек обсушивался и вновь погружался в фиксатор (формалин). Начальный объем кусочка в плазме 1.6 см³.

Опыт №9 (проводился параллельно с опытом №5. Кусочек головного мозга (тот же самый, что и в опыте №5) через каждые 30 минут в течение 2-х часов, затем через 20 часов, извлекался из фиксатора, обсушивался и погружался для измерения объема в центрифужную пробирку со шкалой (цена деления 0.2 см³) в изолированную от того же трупа плазму. Затем кусочек обсушивался и вновь погружался в фиксатор (ацетон). Начальный объем кусочка в плазме 1.6 см³.

б) Сводная таблица к опытам №6-№9

Таблица 2

в) Сводный график к опытам №6-№9

3) Интерпретация опытов №1-№9

Сводные графики предварительных опытов №1-№9 наглядно отображают динамику уменьшения массы и объема изолированных из организма кусочков головного мозга в этиловом спирте, ацетоне и формалине.

Наибольшее уменьшение массы и объема кусочков происходит в первые 120 минут с момента погружения их в фиксатор. Имеется определенное сходство в динамике уменьшения массы и объема в этиловом спирте и ацетоне, с одной стороны, и формалине, с другой стороны. В формалине дальнейшее уменьшение массы и объема кусочков мозга незначительно, а в этиловом спирте и ацетоне, напротив, эти изменения значительны и идут на протяжении всего периода фиксации 75 часов (3-е суток). Эти результаты не противоречат известным наблюдениям за динамикой изменения массы и объема изолированных из организма кусочков различных органов в этиловом спирте, ацетоне и формалине [1].

2. Гипотеза "- объема" и ее экспериментальная проверка

1. Гипотеза "- объема"

Из органической химии известен следующий факт: "При смешивании спирта с водой происходит уменьшение общего объема: так, как при смешивании 52 объемов спирта и 48 объемов воды получается не 100, а 96.3 объема разбавленного спирта" [2]. По Ромейсу [1], "фиксирующее действие спирта основано, прежде всего, на отнятии воды. ...химическое строение белков нарушается спиртом минимально".

Таким образом, при погружении кусочка органа, изолированного из организма, в спирт, последний будет отнимать воду из этого кусочка органа и проникать внутрь его. При этом должен происходить эффект, описанный выше, т.е., вследствие смешивания спирта с водой, должно произойти уменьшение их общего объема и, следовательно, объема всей фиксирующей системы. Обозначим величину "дефекта" объема при смешивании спирта с водой, отнятой из кусочка органа, символом .

Однако, из Ромейса [1] известно, что "цитоплазма (клеток) в результате потери воды и жира большей частью сильно сморщивается. ... уже в процессе фиксации спиртом наступает очень сильное сжатие (фиксируемого кусочка органа)". А это может привести к тому, что объем фиксирующей системы будет уменьшаться на величину за счет отнятия воды из кусочка органа, плюс на величину за счет сморщивания этого кусочка. При отнятии воды из кусочка органа и ее частичном замещении спиртом изменятся конфигурации структурных макромолекул и межмолекулярные расстояния, что приведет к хаотическому сближению ультраструктур клеток и межклеточного вещества органа, что в свою очередь приведет к уменьшению объема кусочка и его сморщиванию. Величина будет являться интегральным выражением этого сморщивания.

Интересно выяснить, существует ли эффект "дефекта" объема при сморщивании кусочка органа в процессе его фиксации в этиловом спирте, ацетоне, формалине.

2) Экспериментальная проверка гипотезы "- объема" при фиксации кусочков головного мозга в этиловом спирте (96°), ацетоне (конц.), формалине (40%)

а) Система для фиксации (рис. 1)

Рис. 1

Система для фиксации, необходимые принадлежности для ее зарядки, фиксаторы, кусочки мозга помещаются в термостат ТС-80. Вначале при зарядке системы склянка заполняется фиксатором при помощи мерного цилиндра (емкостью 10 см³ и ценой деления шкалы 0.1 см³ ) до определенного уровня, соблюдая необходимые предосторожности для исключения испарения фиксатора из открытой системы. Затем склянка плотно закрывается резиновой пробкой с герметично вставленной в нее стеклянной трубкой. Окончательная зарядка системы до необходимого уровня производится при помощи инсулинового шприца (емкостью 2.0 см³) через резиновую трубку, прокалывая последнюю тонкой инъекционной иглой. Таким образом систему для фиксации можно заполнить фиксирующим раствором до необходимого уровня с погрешностью порядка 0.1 см³.

Кусочки мозга известной массы и объема (в плазме) будем помещать в систему, затем заряжать ее до определенного уровня. Так как система для фиксации очень чувствительна к изменениям температуры, целесообразно, при постановке опытов по фиксации в ней, ставить контроль, т.е. точно такую же систему, заряженную одним лишь фиксатором. Через определенные интервалы времени, после погружения в систему кусочка мозга, производится регистрация объема системы по шкале пипетки с погрешностью 0.1 см³.

б) Модельные опыты и их интерпретация

Модельный опыт №1. Система для фиксации заряжается этиловым спиртом (96°) до уровня 0 по шкале пипетки. Затем порциями по 0.2 см³ в резинку вводится 2.0 см³ дистиллированной воды. После введения каждой порции воды по шкале пипетки регистрируется общий объем системы. Исходный объем спирта в системе 51.1 см³. Опыт проводится при температуре 23°С.

Модельный опыт №2. То же самое, что и в модельном опыте №1, исходный объем спирта в системе 51.8 см³.

Модельный опыт №3. То же самое, что и в модельном опыте №1, исходный объем спирта в системе 51.7 см³.

Модельный опыт №4. То же самое, что и в модельном опыте №1, исходный объем спирта в системе 51.8 см³.

Модельный опыт №5. То же самое, что и в модельном опыте №1, исходный объем спирта в системе 110.4 см³.

Модельный опыт №6. То же самое, что и в модельном опыте №1, исходный объем спирта в системе 109.6 см³.

Сводная таблица модельных опытов №1 - №6

Таблица 3

Графики модельных опытов №1-№6

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

Из графиков к модельным опытам №1 - №6 следует, что зависимость V_э(VH₂O) в интервале значений 0VH₂O3.2 (см³) носит линейный характер и, следовательно, описывается функцией вида

f(x) = ax + b,

где x = VH₂O , b = VC₂H₅OH, а = tg a, где a - угол наклона эмпирической прямой к оси VH₂O,

f(x) = V _э (VH₂O);

где i = 1, 2, ..., 6.

tga₁ = 0.83;

tga₂ =0.85;

tga₃ =0.85;

tga₄ =0.85;

tga₅ =0.90;

tga₆ =0.88;

Следовательно, зависимость V _э (VH₂O) в интервале значений 0 VH₂O 3.2 (см³) имеет вид:

V _э (VH₂O) = 0.86 VH₂O + VC₂H₅OH (2)

в) Опыты №10-№17

Опыт №10. Кусочек головного мозга размерами приблизительно 1х1х1.3 (см), массой 910 мг, изолирован из мозга мужчины 49 лет через 23 часа с момента наступления внезапной смерти. При осмотре через микроскоп МБС-1: кусочек мозга бледно-розового цвета, желеобразной мягко-эластической консистенции, с гладкой глянцевой поверхностью, с четкой границей между серым и белым веществом. Фиксация проводилась при температуре 23°С в 52.9 мл этилового спирта (96°) в описанной выше системе для фиксации. Через определенные интервалы времени в течение 3-х суток регистрировался уровень фиксатора в системе по шкале пипетки. После окончания фиксации масса кусочка мозга - 450 мг, объем - 0.4 см³ (в спирте).

Опыт №11. Кусочек головного мозга размерами приблизительно 1х1х1.5 (см), массой 930 мг, изолирован из мозга мужчины 47 лет через 52 часа с момента наступления внезапной смерти. При осмотре через микроскоп МБС-1: кусочек мозга бледно-розового цвета, желеобразной мягко-эластической консистенции, с гладкой глянцевой поверхностью, с четкой границей между серым и белым веществом. Фиксация проводилась при температуре 23°С в 37.1 мл этилового спирта (96°) в системе для фиксации. Уровень фиксатора в системе регистрировался так же как и в опыте №10. После окончания фиксации масса кусочка мозга - 560 мг, объем - 0.4 см³ (в спирте).

Опыт №12. Кусочек головного мозга размерами приблизительно 1.5х1.5х1 (см), массой 1770 мг, объемом в плазме 2.0 см³, изолирован из мозга мужчины 40 лет через 22 часа с момента наступления внезапной смерти. При осмотре через микроскоп МБС-1: кусочек мозга бледно-розового цвета, желеобразной мягко-эластической консистенции, с гладкой глянцевой поверхностью, с четкой границей между серым и белым веществом. Фиксация проводилась при температуре 24°С в 108.4 мл этилового спирта (96°) в системе для фиксации. Уровень фиксатора в системе регистрировался так же как и в опыте №10. Поставлен контроль: система объемом 110.4 мл. Изготовлены диапозитивы методом макросъемки кусочка мозга до и после фиксации. После окончания фиксации масса кусочка мозга - 890 мг, объем в плазме - 1.4 см³ .

Опыт №13. Кусочек головного мозга размерами приблизительно 1.5х1.5х0.5 (см), массой 1790 мг, объемом в плазме 1.8 см³, изолирован из мозга мужчины 37 лет через 14 часа с момента наступления внезапной смерти. При осмотре через микроскоп МБС-1: кусочек мозга бледно-розового цвета, желеобразной мягко-эластической консистенции, с гладкой глянцевой поверхностью, с четкой границей между серым и белым веществом. Фиксация проводилась при температуре 23°С в 116.1 мл этилового спирта (96°) в системе для фиксации. Регистрация уровня фиксатора в системе проводилась в течение суток. Контрольная система та же, что и в опыте №12. Изготовлены диапозитивы методом макросъемки кусочка мозга до и после фиксации. После окончания фиксации масса кусочка мозга - 1150 мг, объем в плазме - 1.4 см³ .

Опыт №14. Кусочек головного мозга размерами приблизительно 1.5х1х0.5 (см), массой 1670 мг, объемом в плазме 1.6 см³, изолирован из мозга мужчины 53 лет через 32 часа с момента наступления внезапной смерти. При осмотре через микроскоп МБС-1: кусочек мозга бледно-розового цвета, желеобразной мягко-эластической консистенции, с гладкой глянцевой поверхностью, с четкой границей между серым и белым веществом. Фиксация проводилась при температуре 23°С в 117.8 мл этилового спирта (96°) в системе для фиксации. Уровень фиксатора в системе регистрировался так же как и в опыте №10. Контрольная система та же, что и в опыте №12. Изготовлены диапозитивы методом макросъемки кусочка мозга до и после фиксации. После окончания фиксации масса кусочка мозга - 950 мг, объем в плазме - 1.0 см³ .

Опыт №15. Кусочек головного мозга размерами приблизительно 1.5х1х0.5 (см), массой 1730 мг, объемом в плазме 1.7 см³, изолирован из мозга мужчины 49 лет через 30 часа с момента наступления внезапной смерти. При осмотре через микроскоп МБС-1: кусочек мозга бледно-розового цвета, желеобразной мягко-эластической консистенции, с гладкой глянцевой поверхностью, с четкой границей между серым и белым веществом. Фиксация проводилась при температуре 24.5°С в 117.9 мл этилового спирта (96°) в системе для фиксации. Уровень фиксатора в системе регистрировался так же как и в опыте №10. Контрольная система та же, что и в опыте №12. Изготовлены диапозитивы методом макросъемки кусочка мозга до и после фиксации. После окончания фиксации масса кусочка мозга - 920 мг, объем в плазме - 1.0 см³ .

После окончания фиксации в этиловом спирте (96), ареометром для спирта определялась его крепость. Во всех опытах с этиловым спиртом она составляла 96, т.е. оставалась такой же как и до фиксации.

Опыт №16. Кусочек головного мозга размерами приблизительно 1.5х1х0.5 (см), массой 1600 мг, объемом в плазме 1.6 см³, изолирован из мозга мужчины 49 лет через 30 часа с момента наступления внезапной смерти и заморожен. Через 70 часов с момента наступления смерти кусочек мозга разморожен и его температура доведена до 23.5°С. При осмотре через микроскоп МБС-1: кусочек мозга бледно-розового цвета, желеобразной мягко-эластической консистенции, с гладкой глянцевой поверхностью, с четкой границей между серым и белым веществом. Фиксация проводилась при температуре 23.5°С в 111.4 мл формалина (40%) в системе для фиксации. Уровень фиксатора в системе регистрировался так же как и в опыте №10. После окончания фиксации масса кусочка мозга - 1320 мг, объем в плазме - 1.4 см³ .

Опыт №17. Кусочек головного мозга размерами приблизительно 1.5х1х0.5 (см), массой 1630 мг, объемом в плазме 1.6 см³, изолирован из мозга мужчины 49 лет через 30 часа с момента наступления внезапной смерти и заморожен. Через 110 часов с момента наступления смерти кусочек мозга разморожен и его температура доведена до 23С. При осмотре через микроскоп МБС-1: кусочек мозга бледно-розового цвета, желеобразной мягко-эластической консистенции, с гладкой глянцевой поверхностью, с четкой границей между серым и белым веществом. Фиксация проводилась при температуре 28 - 23°С в 112.4 мл ацетона (конц.) в системе для фиксации. Уровень фиксатора в системе регистрировался так же как и в опыте №10. Поставлена контрольная система объемом 114 мл. После окончания фиксации масса кусочка мозга - 700 мг, объем - 1.0 см³ .

г) Сводная таблица опытов №10-№17

Таблица 4

д) Графики к опытам №10-№17

е) Интерпретация опытов №10-№17

1

При осмотре кусочков мозга через микроскоп МБС-1 после фиксации в этиловом спирте (96°), ацетоне (конц.), формалине (40%): цвет кусочков - бледно-серый, по консистенции кусочки мозга близки к пластилину, эластичность утеряна, поверхность неровная, глянец исчез, но явных морщин не наблюдается, граница между серым и белым веществом не видна.

При опускании кусочков мозга в дистиллированную воду, после фиксации в этиловом спирте и ацетоне, они в начале остаются на плаву, а затем через несколько часов тонут; после фиксации в формалине кусочки мозга тонут в дистиллированной воде сразу. Плотность кусочков мозга в процессе фиксации в этиловом спирте (96°), ацетоне (конц.), формалине (40%) уменьшается (Таблица 5).

Если после фиксации в этиловом спирте, ацетоне или формалине кусочек мозга выдержать примерно сутки в водопроводной воде, а затем вновь осмотреть через микроскоп, то внешне он будет выглядеть почти так же, как и сразу после фиксации, станет лишь несколько мягче, т.е. признаков обратимости процесса фиксации не выявляется.

Изменение плотности кусочков мозга в процессе фиксации в этиловом спирте (96°), ацетоне (конц.), формалине (40%)

Таблица 5

2

"При рассматривании фиксированного препарата нужно учитывать, что около 80% живого вещества состоит из воды, 12% - из белков и 7% - из жиров и жироподобных веществ и что большая часть этих сухих веществ при жизни находится в растворенном состоянии..." (Ромейс [1]).

Процесс фиксации кусочка мозга в этиловом спирте (96°) при температуре t°C можно абстрактно, после некоторого корректного упрощения, описать в формализованном виде следующим уравнением:

{V₁(A) + V'₁(H₂O)} + V₂(C₂H₅OH) = {V₁(A) + V' ₂(C₂H₅OH)} +  (V₂ - V₂')(C₂H₅OH) + V'₁(H₂O) +V      (e.2. 1)

Мы принимаем здесь следующие корректные упрощения:

1) считаем, что вода, входящая в исходный этиловый спирт (96°), т.е. (V₂(C₂H₅OH)), никакого влияния на процесс фиксации не оказывает и ее количеством можно пренебречь;

2) считаем, что в процессе фиксации из кусочка мозга {V₁(A) + V'₁(H₂O)} выходит в фиксатор практически вся вода V'₁(H₂O), т.е. 80% от исходной массы кусочка, а вместо воды в мозг входит некоторое количество этилового спирта V'₂(C₂H₅OH) , т.е. после фиксации вместо {V₁(A) + V'₁(H₂O)} получается {V₁(A) +V'₂(C₂H₅OH)}.

3) считаем, что кусочек мозга состоит только из сухого вещества А (V₁(A)) и воды V'₁(H₂O), т.е. {V₁(A) + V'₁(H₂O)}.

Если в процессе фиксации имеет место явление появления "дефекта объема" , то -фактическое будет несколько больше, чем -теоретическое, которое можно рассчитать на основании модельных опытов из уравнения (2), которое принимает вид:

V _э (V'₁(H₂O)) = 0.86 V'₁(H₂O) + V₂(C₂H₅OH) . (e.2.2)

V'₁(H₂O) находим из выражений:

m{V₁(A) + V'₁(H₂O)} - 100% 

m (V'₁(H₂O)) - 80%

m (V'₁(H₂O)) = 80m{V₁(A) + V'₁(H₂O)}/100.

По справочнику [3] находим удельный вес воды при температуре фиксации t°C:

r= m (V '₁(H₂O))/ V '₁(H₂O),

откуда

V '₁(H₂O) = m (V '₁(H₂O))/r.

-теоретическое = V'₁(H₂O) - 0.86 V'₁(H₂O).

Анализ опыта №10

m{V₁(A) + V'₁(H₂O)} = 910 мг;

m (V'₁(H₂O)) = 728 мг;

r(H₂O) при 23°С =997.53 мг/ см³.

V'₁(H₂O) = 0.7 см³;

-теоретическое = 0.1 см³;

-фактическое = 0.2 см³;

-фактическое>-теоретическое.

Из опыта №10 следует, что существует.

Анализ опыта №11

m{V₁(A) + V'₁(H₂O)} = 930 мг;

m (V'₁(H₂O)) = 744 мг;

r(H₂O) при 23°C = 997.53 мг/ см³.

V'₁(H₂O) = 0.7 см³;

-теоретическое = 0.1 см³;

-фактическое = 0.3 см³;

-фактическое>-теоретическое.

Из опыта №11 следует, что существует.

Анализ опыта №12

m{V₁(A) + V'₁(H₂O)} = 1770 мг;

m (V'₁(H₂O)) = 1416 мг;

r(H₂O) при 24°C = 997.29 мг/ см³.

V'₁(H₂O) = 1.4 см³;

-теоретическое = 0.2 см³;

-фактическое = 0.2 см³;

-фактическое=-теоретическое.

Из опыта №12 следует, что не существует.

Анализ опыта №13

m{V₁(A) + V'₁(H₂O)} = 1790 мг;

m (V'₁(H₂O)) = 1432 мг;

r(H₂O) при 23°C = 997.53 мг/ см³.

V'₁(H₂O) = 1.4 см³;

-теоретическое = 0.2 см³;

-фактическое = 0.25 см³;

-фактическое>-теоретическое.

Из опыта №13 следует, что существует.

Анализ опыта №14

m{V₁(A) + V'₁(H₂O)} = 1670 мг;

m (V'₁(H₂O)) = 1336 мг;

r(H₂O) при 23°C = 997.53 мг/ см³.

V'₁(H₂O) = 1.3 см³;

-теоретическое = 0.2 см³;

-фактическое = 0.4 см³;

-фактическое>-теоретическое.

Из опыта №14 следует, что существует.

Анализ опыта №15

m{V₁(A) + V'₁(H₂O)} = 1730 мг;

m (V'₁(H₂O)) = 1384 мг;

r(H₂O) при 24°C = 997.29 мг/ см³.

V'₁(H₂O) = 1.4 см³;

-теоретическое = 0.2 см³;

-фактическое = 0.3 см³;

-фактическое>-теоретическое.

Из опыта №15 следует, что существует.

V может возникнуть за счет испарения этилового спирта из системы. Однако из опыта №10, например, следует с очевидностью, что эта причина исключается. Система для фиксации в этом отношении весьма надежна.

Какую часть в % от исходного объема кусочка мозга составляет величина V в опытах №12-№15?

В опыте №12 - 0.

В опыте №13 - 2.3%.

В опыте №14 - 12.5%.

В опыте №15 - 5.9%.

В среднем - 5.2%.

На основании опытов №10-№15 можно с большой вероятностью утверждать, что гипотезы

"- объема" при фиксации кусочков мозга в этиловом спирте (96°) подтверждается и величина при этом составляет около 5.2% от исходного объема кусочка головного мозга.

Анализ опыта №16

При фиксации кусочка мозга в формалине (40%) в системе для фиксации, объем системы в течение 91 часа наблюдения не изменялся.

Из опыта №16 следует, что в формалине (40%) явление "- объема", вероятно, не существует.

Анализ опыта №16

При фиксации кусочка мозга в ацетоне (конц.), наблюдается явление "- объема" и, по всей вероятности, оно даже более выражено, чем при фиксации кусочков мозга в этиловом спирте (96).

На графиках №12-№15, №17 видно, что уровень фиксатора в опытной и контрольной системах для фиксации синхронно то поднимается, то опускается. Это связано с несовершенством терморегуляции в термостате ТС-80. Изменение наружной температуры приводит к изменениям температуры в термостате. Отсчет значений уровня фиксатора в системе по графикам проводился с учетом этого факта.

3) Элементарная геометрическая модель фиксации (Рис. 2)

(Модель воздушных шариков)

Рис. 2

Заключительные выводы

1. Наибольшее уменьшение массы и объема кусочков мозга при фиксации в этиловом спирте (96°), ацетоне (конц.), формалине (40%) происходит в первые, примерно, 120 минут с момента погружения их в фиксатор.

2. Имеется определенное сходство в динамике уменьшения массы и объема кусочков мозга при фиксации в этиловом спирте (96°), ацетоне (конц.), формалине (40%) в первые примерно 60 минут. Затем наступает резкое различие в динамике уменьшения массы и объема в формалине, где дальнейшее уменьшение массы и объема кусочков мозга незначительно, по сравнению с этиловым спиртом и ацетоном, где происходит дальнейшее значительное уменьшение массы и объема на протяжении всего периода фиксации.

3. Процесс фиксации можно изучать в предложенной системе для фиксации.

4. Можно моделировать процесс фиксации в этиловом спирте, применяя систему для фиксации, используя явление "- объема" при смешивании спирта с водой.

5. При фиксации кусочков головного мозга в этиловом спирте впервые обнаружено явление "V- объема", предсказанное гипотезой "- объема". Явление "- объема", вероятно, имеет место и при фиксации кусочков мозга в ацетоне. При фиксации в формалине явление "- объема" не обнаружено.

6. При фиксации кусочков головного мозга в этиловом спирте (96) величина составляет примерно 5.2% от исходного объема кусочка мозга.

7. Подтверждение гипотезы "- объема" позволяет предложить элементарную геометрическую модель фиксации - "модель воздушных шариков".

8. Процесс фиксации кусочков мозга в этиловом спирте (96°), ацетоне (конц.), формалине (40%) приводит к глубоким качественным и количественным морфологическим изменениям исследуемых образцов биологических тканей, и эти изменения необратимы.

9. В процессе фиксации происходит уплотнение вещества кусочков мозга, однако их плотность в этиловом спирте (96°), ацетоне (конц.), формалине (40%) уменьшается по сравнению с исходной.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ромейс Б. Микроскопическая техника. - М.:Иностранная литература, 1953. - С. 48 -50.

2. Степаненко Б. Н. Курс органической химии. - М.: Высшая школа, 1966. - С. 116.

3. Гороховский И. Т., Назаренко Ю. П., Некряч Е. Ф. Краткий справочник по химии. - Киев: Наукова думка, 1974. - С. 775.

II

БИОФИЗИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ЯВЛЕНИЕ, ВОЗНИКАЮЩЕЕ ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ В ИЗОТЕРМИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ КОМПОНЕНТОВ СИСТЕМЫ {ОБРАЗЕЦ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ТКАНИ - ЭТАНОЛ}, И ЕГО ВОЗМОЖНОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ СТЕПЕНИ ГИДРАТАЦИИ ОБРАЗЦОВ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ

1

НАРУШЕНИЕ АДДИТИВНОСТИ ОБЪЕМОВ ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ В ИЗОТЕРМИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ КОМПОНЕНТОВ СИСТЕМЫ

{ОБРАЗЕЦ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ТКАНИ - ЭТАНОЛ}

Теоретический этюд

Если при произвольном разбиении какого-либо объекта объемом V на n частей, имеющих объемы V_i ( i=1, 2, 3, ... ,n), выполняется равенство

(1)

то говорят, что для этого разбиения соблюдается аддитивность объемов [1].

В химии известен феномен неаддитивности объемов бинарных смесей, для которых равенство (1) не выполняется. Классическим примером такой бинарной смеси является смесь вода-этанол [2].

Действие этанола как фиксатора основано на дегидратации биологических тканей [3] и осаждении белков [4]. В процессе фиксации в системе биологическая ткань-этанол происходит диффузия воды из ткани в этанол и этанола в ткань. При этом происходит уменьшение объема исследуемого образца ткани, проявляющееся гистологически в различной степени сморщивания ядер и цитоплазмы клеток, а также межклеточного вещества. Отмечается парадоксальный феномен: чем выше концентрация этанола, тем меньше проявляется сморщивание, минимальное сморщивание происходит в "абсолютном" этаноле.

В процессе фиксации биологической ткани в этаноле при изотермических условиях происходят объемные изменения в системе ткань-этанол, которые можно количественно описать уравнениями аддитивности объемов:

(2) V₁ + V₄ - V₅ = {V₁ + V₄ - V₅} +V';

(3) {V₁ + V₂ + V₃} = V₁ +{ V₂ + V₃} - V'';

(4) V₂ + V₃ + V₅ = {V₂ + V₃ + V₅ }+V''';

(5) V= V' - V'' + V''',

где V₁ - объем свободной воды в ткани, V₂ - объем связанной воды в ткани, V₃ - объем сухого вещества в ткани, V₄ - объем этанола в системе, V₅ - объем этанола, перешедшего в ткань, V, V', V'', V''' - дополнения до аддитивности объема системы, {}- объем смеси. В уравнениях (2-5) не учитываются объемные изменения, происходящие в системе ткань-этанол при растворении органических веществ ткани в этаноле, т. к., во-первых, установлено, что наибольшее значение дополнение до аддитивности из известных бинарных эквимолекулярных органических смесей имеет система вода-этанол, а все остальные бинарные смеси имеют значительно меньшее абсолютное значение дополнения до аддитивности [5]; во-вторых, в этаноле растворяется незначительное количество органического вещества ткани.

В уравнении (2) величина V' появляется в следствие неаддитивности объемов воды и этанола и их смеси. В уравнениях (3) и (4) величины V'' и V''' вводятся по аналогии с экспериментальными данными по гидратации сухого белка (эластина) [5]. Так как при дегидратации ткани суммарный объем свободной воды, вышедшей из ткани, и оставшейся ткани больше, чем объем ткани до дегидратации, то величина V'' в уравнении (3) взята со знаком "минус". В уравнении (4) суммарный объем ткани и этанола до смешивания больше, чем объем ткани после ее пропитывания этанолом, поэтому величина V''' имеет знак "плюс". Для дополнений до аддитивности в уравнениях (2-5) справедливы следующие соотношения:

(6) |V ''| > |V''' |;

(7) |V' | > |V'' |.

Соотношение (6) следует из гистологических данных по фиксации ткани в этаноле: при любых концентрациях этанола имеет место сморщивание ткани, т. е. ткань в процессе фиксации в этаноле никогда не возвращается к исходному объему. Соотношение (7) следует из уравнения (5), соотношения (6) и экспериментальных данных по регистрации суммарного значения дополнений до аддитивности в системе ткань-этанол, которое имеет знак "плюс".

В уравнении (5) величины V'' и V''' взаимно частично гасятся. При фиксации ткани в "абсолютном" этаноле их взаимное гашение будет максимальным, т. к., чем выше концентрация этанола, тем большее значение будет иметь V₅ в уравнении (4), тем большее значение будет иметь величина V''' и тем меньшее значение будет иметь разность

|V''| - |V''' |,

что в свою очередь будет давать меньшее сморщивание ткани, что хорошо согласуется с гистологическим парадоксальным феноменом, приведенном выше.

Из этого можно сделать следующее заключение: большая часть значения суммарного дополнения до аддитивности в системе ткань -этанол приходится на величину V', обусловленную выходом свободной воды из ткани в этанол. Априорно допускаем, что разность |V''| - |V'''| при фиксации ткани в этаноле настолько мала, что ею можно пренебречь, уравнение (5) при этом принимает вид

(8) V» V'.

Известно, что при смешивании 52 объемов этанола и 48 объемов воды получается 96.3 объемов смеси [2]. При этом величина V=3.7 объемов. Зависимость V(V₁) приближается к линейной

V(V₁)= aV₁,

откуда следует, что

По справочным таблицам определяем плотность воды при температуре фиксации. Учитывая, что r=m/V , где m - масса свободной воды, выводим окончательную формулу для определения массы свободной воды в исследуемом образце биологической ткани:

(10)

2

ИЗМЕРЕНИЯ СТЕПЕНИ ГИДРАТАЦИИ ОБРАЗЦОВ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ

Описанное выше биофизико-морфологическое явление нашло применение при разработке способов измерения степени гидратации образцов биологических тканей, без разрушения последних и при их одновременной химической фиксации, что имеет большое значение при гистологических исследованиях биологических тканей, находящихся в состоянии гипергидратации (отек, набухание), дегидратации (эксикоз), представляющих собой универсальные неспецифические реакции организма в ответ на множество специфических внешних и внутренних воздействий и проявляющихся в той или иной степени в том или ином месте практически при всех заболеваниях.

При решении этой задачи было предложено и представлено на патентную экспертизу четыре идеи, которые после успешного завершения последней имеют следующий вид [6-13].

Формулы изобретений

***

Способ определения свободной воды в биологических тканях [6], включающий погружение образца плотной ткани в жидкую среду с последующим расчетом количества свободной воды в нем, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, образец погружают в 96° этанол и термостатируют в течение 1 ч, затем регистрируют изменение объема системы ткань-этанол (V) каждые 10 мин. до момента его стабилизации, измеряют плотность воды (r), весь процесс ведут в изотермических условиях, а расчет массы свободной воды (m) в исследуемом образце осуществляют по формуле

m = (Vr)/0.0771.

***

Способ фиксации нервной ткани [7] путем погружения в этанол, отличающийся тем, что с целью повышения качества способа за счет сохранения структурных взаимоотношений, фиксацию проводят в изотермических условиях, при этом вначале определяют значения объема системы ткань-фиксатор, далее регистрируют динамику уменьшения значения этой системы, а окончание фиксации определяют по стабилизации этого значения.

***

Устройство для фиксации биологической ткани [8], содержащее сосуд с герметичной крышкой, отличающееся тем, что, с целью определения момента фиксации образца, оно снабжено узлом подачи фиксирующего раствора, связанным с сосудом и отводным патрубком со шкалой, размещенным в зоне горловины под тупым углом от донной части сосуда.

***

Устройство для определения содержания свободной воды в биологических тканях [9], включающее корпус, герметично закрывающийся крышкой, с патрубками для заполнения корпуса этанолом и регистрирующее устройство, отличающееся тем, что крышка дополнительно снабжена чувствительным элементом в виде мембраны, а внутри корпуса имеется держатель биологической ткани в виде фланца с расположенными по окружности гнездами со сквозными ступенчатыми отверстиями, в верхней части которых размещена биологическая ткань, заключенная в герметические капсулы, а в нижней - подпружиненная толкателями с режущими вставками для перфорации капсул, приводимые в движение электроприводом

Идеи этих изобретений были положены в основу разработки действующего макета прибора [10] для определения содержания "свободной" воды (степени гидратации) в жидких и плотных образцах биологических тканей, без разрушения последних, получившего рабочее наименование "Аквант" (рис. 3).

Рис. 3. Испытание прибора "Аквант" на функционирование

На снимке (слева направо) М. М. Махнач, Р. З. Гумиров, В. В. Жилкин, В. А. Глотов

В процессе испытания прибора на функционирование (моделирования процесса фиксации образца биологической ткани в этаноле) в результате взаимодействия этанола с водой было многократно зарегистрировано интересное явление, характеризующее динамику изменения объема системы {образец биологической ткани - этанол} (рис. 4).

Рис. 4. Распечатка из протокола опыта № 13.

В реакторе находились четыре заряженных дистиллированной водой капсулы, которые по очереди пробивались. В результате пробоя капсул вода поступала в этанол и происходила экзотермическая физико-химическая реакция растворения воды в этаноле. Из-за разогревания в результате этой реакции объем системы вначале увеличивался, а после возвращения системы к исходной температуре, ее объем становился меньше исходного.

3

ПРОГНОЗИРУЕМАЯ МОДЕЛЬ СКАНЕРА ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ СТЕПЕНИ ГИДРАТАЦИИ ОБРАЗЦОВ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ

Прибор должен представлять собой контрольно-измерительный комплекс, состоящий из сканера, единичным элементом которого является микроробот: модуль-реактор для определения содержания "свободной" воды в единичном жидком или плотном образце биологической ткани. Число таких элементов может быть произвольным и зависит от поставленной задачи. Образец биологической ткани в специальной герметичной управляемой капсуле помещается внутрь модуля-реактора, реактор автоматически герметизируется и заполняется реакционной средой (этанолом). После автоматической настройки модуля-реактора на рабочее состояние, происходит управляемое раскрытие капсулы и запускается физико-химическая реакция, в результате которой происходят объемные изменения системы {образец биологической ткани - этанол}, которые отслеживаются специальной системой датчиков. Вся информация о ходе реакции поступает от сканера в компьютер, где обрабатывается специальной программой с элементами искусственного интеллекта, которая обеспечивает управление модулями-реакторами сканера.

Оператор получает следующую информацию (на мониторе компьютера в реальном времени, распечатку на принтере или самописце в реальном времени, в виде специального файла в режиме длительного автоматического сканирования):

1. количество "свободной" воды в образцах биологических тканей;
2. количество "свободной" воды в тестируемых тканях и органах;
3. карту распределения "свободной" воды в органах и тканях организма человека и ли животного;
4. экспертную оценку состояния исследуемых тканей и органов по параметру содержания "свободной" воды.
5. экспертную оценку состояния пациента, либо трупа по параметру содержания "свободной" воды.

Чем больше прибор эксплуатируется, тем более точная будет экспертная оценка. Результаты измерений архивируются по специальной системе. Экспертная система позволяет проводить автоматический анализ архивных материалов по множеству критериев, определяемых пользователем.

После определения содержания "свободной" воды в образце биологической ткани, последний готов для дальнейшей стандартной гистологической обработки.

Масса исследуемого образца биологической ткани от 70 до 200 мг.

Среднее время измерения содержания "свободной" воды в образце биологической ткани составляет 6-8 часов.

Измерения проводятся при комнатной температуре.

ЛИТЕРАТУРА

1.БСЭ - М.: Советская энциклопедия, 1970. - Т.1.- С. 221.

2. Степаненко Б. Н. Курс органической химии. - М.: Высшая школа, 1966. - С. 116.

3. Ромейс Б. Микроскопическая техника.- М.: Иностранная литература, 1953. - С. 57.

4. Канонский А. И. Гистохимия. - Киев: Вища школа, 1976. - С.26-27.

5. Вода в полимерах. Ред. С. Роуленд.- М.:Мир, 1984.-C. 237,230-239.

6. Глотов В. А. Способ определения свободной воды в биологических тканях. - Патент РФ №2000570.

7. Глотов В. А. Способ фиксации нервной ткани. - Патент РФ №1792529.

8. Бехтерева И. А., Глотов В. А. Устройство для фиксации биологической ткани. - Патент РФ №1569633.

9. Махнач М. М. Устройство для определения содержания свободной воды в биологических тканях. - Патент РФ №2089903.

10. Махнач М. М. Макетирование прибора для определения содержания свободной воды в биологических тканях. - Математическая морфология. - Смоленск: СГМА, 1997. - Т. 2. - Вып. 2. - С. 144-146.

III

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1.Теоретически предсказано и экспериментально обнаружено биофизико-морфологическое явление, возникающее в процессе взаимодействия биологической ткани, изолированной из организма, с этанолом, характеризующееся изменением объема системы {биологическая ткань - этанол} в изотермических условиях, при котором объем системы вначале увеличивается вследствие разогрева последней в результате экзотермической реакции, развивающейся при диффузии этанола в биологическую ткань и воды из последней в этанол, а затем, после возвращении температуры системы к исходной, уменьшается и становится ниже исходного, вследствии нарушения аддитивности объема образующейся бинарной смеси {вода - этанол}. Разработана теория этого эффекта.

2. Полученные первые результаты мы рассматриваем как пролог будущего систематического и всестороннего исследования этого явления и (на основе последнего) количественного изучения содержания свободной воды (степени гидратации) в плотных и жидких образцах биологических тканей организма, без разрушения анатомической структуры последних, в норме и при различных патологиях.

3. Обнаруженное явление использовано при создании измерительных приборов для определения содержания свободной воды (степени гидратации) в плотных и жидких биологических тканях без их анатомического разрушения, действие которых основано на регистрации динамики изменения объема системы {биологическая ткань - этанол} в результате физико-химической реакции взаимной диффузии этанола в биологическую ткань и свободной воды из последней в этанол, вследствие чего формируется бинарная смесь {вода - этанол}, которая и дает нарушение аддитивности объема системы.

Исследование выполнено при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (Проект РФФИ №94-04-13544 и №96-04-50991).

Резюме

В статье приведены результаты исследования теоретически предсказанного и экспериментально установленного биофизико-морфологического явления, возникающего в процессе взаимодействия биологической ткани с этанолом и характеризующегося изменением объема системы {биологическая ткань - этанол}. Предложена теория этого эффекта, основанная на анализе объемных изменений системы, возникающих в результате взаимной диффузии этанола в биологическую ткань и свободной воды из последней в этанол, вследствие чего формируется бинарная смесь {вода - этанол}, которая дает нарушение аддитивности объема системы. Предложены приборы для регистрации этого эффекта и позволяющие на его основе определять содержание свободной воды в исследуемых жидких и плотных образцах биологических тканей без анатомического разрушения последних.

Кафедра анатомии человека

Смоленская государственная медицинская академия

Поступила в редакцию 5.01.97.