В выпускной квалификационной работе были рассмотрены возможности и особенности современного спектрофлуориметрического оборудования и его применимость для спектральных исследований остеологических образцов. Были проанализированы спектры возбуждения и люминесценции остеологических образцов на спектрофлуориметре «Панорама» с использованием разработанной методики.

Работа может быть полезна специалистам в области медицины, спектрального и люминесцентного анализа.

ВВЕДЕНИЕ

Среди различных инструментальных методов диагностики в медицине оптические методы исследования состояний организма на всех его уровнях играют далеко не последнюю роль и продолжают бурно развиваться. Оптические методы исследования биоструктур (тканей, клеток, белков) основаны на использовании законов оптики, касающихся природы, распространения и взаимодействия с веществом электромагнитного излучения оптического диапазона (видимый свет, ультрафиолетовое и инфракрасное излучение).

К оптическому методу исследования относится люминесцентный анализ — совокупность методов анализа, основанных на наблюдении люминесценции. Для возбуждения люминесценции исследуемый объект подвергается действию ультрафиолетового света. Источниками последнего служат кварцевые газоразрядные ртутные или ксеноновые лампы и УФ лазеры. Регистрируют люминесценцию визуально, фотографически или фотоэлектрически с помощью спектрографов, фотометров и спектрофотометров.

Спектры возбуждения и люминесценции у каждого вещества строго индивидуальны и являются как бы его «паспортом», поэтому, зарегистрировав спектр вещества или смеси веществ, можно определить и вид вещества, состав и процентное содержание компонентов смеси, т.е. провести качественный и количественный люминесцентный анализ.

Качественный люминесцентный анализ основан на различии цвета люминесценции, производимой веществами разной химической природы. Его используют, например, для обнаружения следов люминесцирующих органических и неорганических веществ в различных объектах. Количественный люминесцентный анализ основан на измерении интенсивности люминесценции при помощи флуорометров или путем регистрации спектров люминесценции спектрофлуориметрами.

Различают флуоресценцию, фосфоресценцию и хемилюминесценцию.

Одним из наиболее эффективных дополнительных методов, позволяющий анализировать структуру и состояние белков биологических тканей, контроль гомеостаза живых систем является метод атомно-флуоресцентного анализа.

Актуальность методов исследования флуоресценции конкретных веществ, обладающих высокой чувствительностью, а также удобным временным диапазоном, так как испускание флуоресценции происходит через 10^-9 с (10 нс) после поглощения света. За это время происходит множество различных молекулярных процессов, которые влияют на спектральные характеристики флуоресцирующего соединения. В настоящее время созданы приборы, позволяющие измерять флуоресценцию 10^-18 с зонда в живой клетке за время около 10^-5с, что намного превосходит чувствительность и быстродействие даже таких чувствительных методов, как радиоизотопный и иммуноферментный. Кроме того, исследование флуоресценции позволяет получить информацию о состоянии живых систем, не повреждая их, и не требует большого количества биологического материала.

Имея такие преимущества, флуоресцентные методы позволяют просто и экономично решить многие задачи клинической диагностики, экологического контроля и физико-химического анализа и все шире применяются в медицинских и биохимических исследованиях.

К недостаткам метода атомно-абсорбционной и в определенной мере атомно-флуоресцентной спектрометрии следует отнести затруднительность одновременного определения нескольких элементов.

Целью работы является исследование остеологических образцов методами люминесцентного анализа.

В рамках поставленной цели можно выделить следующие задачи:

1. обзор оптических люминесцентных методов диагностики;

2. разработка методики для изучения остеологических образцов на спектрофлуориметре Флюорат-02-Панорама;

3. исследование спектров возбуждения, люминесценции и её кинетики шлифов костных тканей и слуховых косточек.

1. ОПТИЧЕСКИЕ ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ

1.1. Метод атомно-флуоресцентного анализа

Люминесцентный анализ — совокупность методов анализа, основанных на наблюдении люминесценции. Для возбуждения люминесценции исследуемый объект подвергается действию ультрафиолетового света. Наблюдение свечения производится в темном помещении визуально или при помощи специальных приборов (флуорометров).

Качественный люминесцентный анализ основан на различии цвета люминесценции, производимой веществами разной химической природы; количественный люминесцентный анализ — на измерении интенсивности люминесценции при помощи флуорометров или путем регистрации спектров люминесценции специальными спектрографами [1].

Одним из наиболее эффективных дополнительных методов контроля гомеостаза живых систем является метод атомно-флуоресцентного анализа. Флуоресценция – это испускание, происходящее при возвращении спаренного электрона на более низкую орбиталь. Спектр испускания вещества представляет собой зависимость интенсивности испускания от длины волны при фиксированной длине волны возбуждения света.

Многие молекулы биологических веществ являются природными или естественными флуорофорами, т. е. веществами, способными флуоресцировать в определенном диапазоне длин волн при соответствующих условиях возбуждения, например белки. Установлено, что флуоресцировать в белках способны только ароматические аминокислоты, обладающие системой сопряженных двойных связей. Основным флуоресцирующим компонентом в них является триптофан, который обусловливает около 90% всей белковой флуоресценции. Спектр флуоресценции триптофана в водном растворе представляет собой широкую бесструктурную полосу с максимумом при 348 нм и полушириной в 60 мкм, а его форма и положение максимума определяются преимущественно индольным кольцом молекулы. Триптофансодержащие белки поглощают свет вблизи 280 нм, а спектры флуоресценции сдвинуты в коротковолновую сторону по сравнению со спектрами триптофана в воде. Соответственно значения их максимумов могут изменяться от 343 нм (сывороточный альбумин) до 308 нм (азурин). Основной причиной этого является наличие процессов ориентационного взаимодействия, при которых положение спектра определяется полярностью и жесткостью микроокружения хромофора. Сдвиг максимума в коротковолновую область характерен для малополярного окружения, в длинноволновую – для полярного. Максимумы испускания белков отражают среднюю доступность их триптофановых остатков в водной фазе. Некоторое влияние на положение спектров оказывает комплексообразование с окружающими соединениями. Спектральные сдвиги часто являются следствием связывания лигандов, ассоциации «белок-белок» и денатурации. Конформационно-чувствительными оказались и другие параметры флуоресценции триптофан-содержащих белков: квантовый выход, длительность возбужденного состояния, степень поляризации.

Флуоресценция белков, не содержащих остатков триптофана, но имеющих в своем составе фенилаланин и тирозин, обусловлена только остатками тирозина, который также является природным флуорофором и имеет максимум спектра флуоресценции при 303–304 нм, а его интенсивность на порядок ниже, чем у триптофана. На положении максимума флуоресценции тирозина, в отличие от триптофана, не сказываются конформационные перестройки макромолекулы. Тирозин интенсивно флуоресцирует в растворе и при денатурации белков, сохраняя положение максимума. Его включение в состав белка сопровождается лишь эффектом тушения флуоресценции и падением квантового выхода. Свечение фенилаланина можно наблюдать только у тех немногих белков, которые не содержат других ароматических аминокислот – триптофана и тирозина (например, преальбумин мышц рыбы, гепатокупреин лошади, рибосомальный белок). Спектр флуоресценции фенилаланина имеет максимум при 282 нм, и его квантовый выход еще на порядок ниже, чем у тирозина.

Но если в состав белка входят все три аминокислоты, то в спектре флуоресценции проявляется только один триптофановый максимум. Даже в сывороточном альбумине человека, содержащем 17 остатков тирозина и только один остаток триптофана, свечение тирозина проявляется лишь в виде «плеча» на коротковолновом склоне полосы флуоресценции триптофана. Оказывается, что значительная доля энергии возбуждения, полученная тирозиновыми остатками, может мигрировать на триптофанилы и высвечиваться в качестве триптофанового компонента.

К природным флуорофорам относятся также нуклеиновые кислоты, коферменты и витамины, продукты окисления и пигменты. При обычных условиях водные растворы флуоресцируют слабо, с низким квантовым выходом. Например, для растворов нуклеиновых кислот свечение усиливается в кислой среде. Положение максимума флуоресценции различно для разных веществ, например для ДНК составляет 358 нм и совпадает с максимумом гуанина. Увеличение интенсивности флуоресценции оснований нуклеиновых кислот происходит также при низкой температуре. Примером свечения коферментов и витаминов может служить флуоресценция пиридиннуклеотидов – никотинамидадениндинуклеотида в восстановленной форме (в водном растворе имеет максимум при 470 нм) и витамина А (максимум флуоресценции при 510 нм в этаноле) [2].

Изменение спектра собственной флуоресценции биологических жидкостей при различных заболеваниях. За последние годы существенно расширилось представление о функциональной системе крови. Значительное внимание уделяется вопросам ее регуляции и выявлению механизмов регулирования при различных заболеваниях. Известно, что развитие злокачественных образований, заболеваний печени, суставов и другие патологические процессы вызывают в плазме и сыворотке крови целый ряд отклонений от нормы. Это относится как к количественному, так иногда и к качественному составу плазменных белков, гормонов и т. д. Кроме того, такая биологическая жидкость, как кровь, является очень удобным объектом для изучения флуоресцентными методами.

Специфические изменения параметров флуоресценции сыворотки крови были обнаружены при злокачественных новообразованиях. В экспериментах на крысах с перевитой лимфосаркомой Плисса показано, что развитие опухоли приводит к увеличению интенсивности ультрафиолетовой флуоресценции сыворотки крови на 19–41% и к сдвигу ее спектров на 4–5 нм в коротковолновую область. Другие авторы проводили исследование сыворотки крови при возбуждении ее светом с длиной волны 313 нм и регистрировали спектр сыворотки с максимумами испускания 350 и 470 нм. Диагностически полезным оказался коэффициент, равный отношению интенсивностей этих двух максимумов. Сравнивались флуориметрические данные и окончательный клинический диагноз для различных локализаций злокачественных опухолей. Было показано, что процент совпадения диагностических заключений, сделанных флуориметрическим и клинико-морфологическим способами, зависит от вида опухоли, ее локализации и размера. Наиболее эффективным данный метод оказался для выявления лимфогранулематоза – 90% совпадений, а для большинства локализаций – не хуже, чем при диагностике с помощью определения в крови больного раково-эмбрионального антигена. Аналогичные исследования спектра флуоресценции сыворотки крови были проведены при гемобластозах и различных опухолевых заболеваниях системы крови и также выявили изменения данного специального флуориметрического коэффициента.

Обнаружена связь между величиной интенсивности флуоресценции триптофана в сыворотке крови у хирургических больных и экспериментальных животных с местной и общей гнойной инфекцией, у обожженных в динамике заболевания. Наблюдалась корреляция между увеличением флуоресценции триптофана в безбелковой фракции гомогенатов ряда органов (мышцы, легкие, сердце, печень) и увеличением флуоресценции триптофана в безбелковой фракции сыворотки крови у животных с генерализованной гнойной инфекцией. Более того, наблюдаемые изменения уровня флуоресценции триптофана в терапии больных с общей гнойной инфекцией предшествовали изменениям в клинической картине заболевания и давали возможность контролировать эффективность проводимого лечения. Была также обнаружена корреляция между интенсивностью протеолитических процессов в ране и уровнем флуоресценции триптофана в сыворотке крови. Исходя из этого сделан вывод о том, что интенсивный распад триптофан-содержащих структур под действием протеолитических ферментов приводит к увеличению содержания флуоресцентно определяемого триптофана в крови [2].

На данный момент изучены спектры собственной флуоресценции сыворотки крови больных распространенным гнойным перитонитом. Наблюдались достоверные различия между показателями интенсивности флуоресценции сыворотки крови у таких пациентов по сравнению с контрольной группой, причем при гнойном перитоните с развитием процесса собственная флуоресценция сыворотки крови возрастала. Более детальное исследование спектров флуоресценции сыворотки крови больных перитонитом показало, что высокие показатели интенсивности флуоресценции (по сравнению с контрольной группой) достоверно изменяются в динамике заболевания, отражая, таким образом, степень его тяжести (реактивная, токсическая стадии и стадия полиорганной недостаточности). Кроме того, рост флуоресценции у больных перитонитом на всех стадиях сопровождался изменением протеолитической и ингибиторной активности сыворотки крови (обратная корреляция).

Флуоресцентные методы позволяют также исследовать влияние различных воздействий на состояние белков. Было установлено, что предварительное действие низкоинтенсивного лазерного излучения на растворитель (воду) снижает интенсивность флуоресценции триптофана и эффект тушения сохраняется в температурном диапазоне 8–50^оС, что является следствием изменения свойств растворителя под влиянием электромагнитного излучения при взаимодействии с растворенным веществом. При изучении интенсивности флуоресценции воды и водно-солевых растворов при воздействии комбинированными постоянными и низкочастотными переменными магнитными полями установлено увеличение интенсивности флуоресценции в растворах под действием данных полей и формирование флуоресцирующих ассоциатов. Полученные результаты позволяют предположить, что структурные изменения водных растворов возникли под влиянием слабых электромагнитных полей, проявление которых зависит от химического состава исследуемых растворов и условий хроматографирования.

Флуоресцентные зонды, используемые в медицине. Исследование собственной флуоресценции биологических материалов не всегда позволяет получить желаемую информацию об объекте. В таком случае используют искусственные флуорофоры, т. е. специально синтезированные вещества, имеющие специфический спектр флуоресценции либо в свободном состоянии, либо при связывании с тем или иным объектом исследования. Флуоресценция таких веществ (зондов), как правило, обладает высоким квантовым выходом и достаточно большим временем жизни [2].

С помощью флуоресцентных зондов можно исследовать молекулярные механизмы возникновения и развития патологических процессов, действие на организм биологически активных веществ и лекарственных препаратов. Флуоресцентные зонды применяются также для диагностики и прогноза развития заболеваний, выявления факторов риска и контроля эффективности лечения. Зондовая флуоресценция чувствительна к структурно-функциональным изменениям в биологических мембранах, микровязкости ее липидного бислоя, связыванию с белками и другими веществами, структурным перестройкам в белках, изменению мембранного потенциала и концентрации внутри-клеточного кальция и др. Анализируя спектр флуоресценции клеток и мембран, связанных с зондом, можно определить полярность микроокружения флуорофора. Интенсивность и время жизни флуоресценции зонда характеризуют подвижность сольватной оболочки, поляризация флуоресценции – вращательную подвижность, ориентацию и вязкость микроокружения зонда. Тушение флуоресценции зонда посторонними веществами позволяет установить доступность флуорофора для тушителя, его локализацию в белках и мембранах клеток и их проницаемость для тушителей, скорость диффузии. По переносу энергии возбуждения с мембранных белков на флуоресцентный зонд и по степени эксимеризации зонда можно определить расстояние между флуорофорами и вязкость среды, окружающей зонд.

Одним из важнейших звеньев в молекулярном механизме действия на организм биологически активных соединений является мембрана. С помощью мембранных зондов можно определить сродство лиганда к мембране, скорость

проникновения через нее и его локализацию в клетках и тканях, выяснить связь проницаемости лиганда с его активностью, изучить его действие на структуру и физико-химические свойства мембраны и др. К мембранным зондам относятся такие вещества, как 1-анилинонафталин-8-сульфонат, пирен, перилен, 4-(n-диметиламиностирил)-N-метилпиридиния, n-толуолсульфонат 4-(n-диметиламиностирил)-1-гексилпиридиния и т. д. Такие зонды позволяют непосредственно наблюдать за процессом проникновения веществ через мембрану, встраиваясь в нее и меняя свою флуоресценцию под действием различных факторов и соединений.

Основным механизмом, позволяющим с помощью зондов получить информацию об исследуемом объекте – мембране, является индуктивно-резонансный перенос энергии, т. е. энергии возбужденного состояния от донора к акцептору, который определяется в основном диполь-дипольными взаимодействиями между ними. Такой обмен энергии может осуществляться либо между различными молекулами, либо между частями одной и той же молекулы.

Скорость переноса энергии зависит от степени перекрывания спектра испускания донора со спектром поглощения акцептора, относительной ориентации дипольных моментов переходов и расстояния между молекулами. Данный перенос энергии является безызлучательным и содержит богатую информацию, касающуюся строения молекул донорно-акцепторных пар. Любые явления, влияющие на расстояние между донором и акцептором, будут воздействовать на скорость переноса энергии, а следовательно, позволят их количественно охарактеризовать.

Так, на основании изучения индуктивно-резонансного переноса энергии между двумя хромофорами, локализованными в разных участках эритроцитарной мембраны, было сделано заключение, что под действием радиации в ней уменьшается эффективная толщина гидрофобной области. В дальнейшем оно подтверждено исследованием параметров флуоресценции зондов – пирена и 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриена в облученных мембранах эритроцитов крыс. После облучения происходило уменьшение флуоресценции зондов и времени жизни возбужденного состояния по сравнению с контрольной группой вследствие динамического тушения водой. При исследовании физико-химического состояния мембран жировой ткани и печени крыс в отдаленные сроки после γ-облучения и структурных изменений мембран было обнаружено следующее. За счет переноса энергии с мембранных триптофанилов на пирен при длине волны возбуждения 286 нм наблюдают флуоресценцию зонда, локализованного в прибелковой части липидного бислоя (аннулярный липид), при возбуждении с длиной волны 330 нм – пирена, локализованного как вблизи белка, так и в липидном слое (общий липид). Рассчитанный коэффициент эксимеризации пирена позволил установить структурную модификацию плазматических мембран жировой ткани и печени крыс после однократного γ-облучения в дозе 1 г, выражающуюся в увеличении микровязкости липидной фазы мембран как в прибелковой области, так и в области суммарного липида. Для изучения структурных перестроек в мембранах эритроцитов, митохондрий, жировой ткани и печени крыс после радиационного воздействия использовался не только пирен, но и другие флуоресцентные мембранные зонды (2-n-толуидиннафталин-6-сульфоновая кислота, 4-диметиламинохалкон, перилен).

С помощью механизма индуктивно-резонансного переноса энергии было изучено структурное и физико-химическое состояние мембран эритроцитов у пациентов с хроническими заболеваниями печени. Выявлено уменьшение эффективности переноса энергии с мембранных триптофанилов на пирен у этих больных по сравнению с контрольной группой, что выражалось в снижении количества белка, доступного тушению зондом. Уменьшение параметра эксимеризации пирена свидетельствовало об увеличении микровязкости липидного бислоя мембран и уменьшении его текучести. Полученные данные позволили сделать вывод о том, что при хронических заболеваниях печени происходят значительные структурные перестройки в белках мембран эритроцитов.

Мембранные зонды можно использовать при диагностике таких заболеваний, как инфаркт миокарда, нестабильная стенокардия, нейроциркуляторная дистония по гипертензивному типу, хронический алкоголизм. Анализ параметров связывания зондов ДСМ и ДСП-6 с мембранами эритроцитов позволил выявить структурно-функциональные изменения мембран и дифференцировать отдельные группы больных при перечисленных заболеваниях.

При гипоксическом синдроме также были зафиксированы изменения в микровязкости мембран эритроцитов и уменьшение интенсивности флуоресценции мембранного зонда пирена.

Такие зонды, как пирен, использовались для выявления нарушений в структуре мембран клеток и изменения мембранного потенциала при гипертонической болезни, экспериментальном гипертиреозе и миокардите, химическом канцерогенезе. С помощью пирена обнаружены нарушения структуры микросом печени при авитаминозе А. С помощью флуоресцентного зонда нистатина у больных гломерулонефритом было показано снижение интенсивности флуоресценции зонда в суспензии эритроцитов, что также позволило оценить структурно-функциональное состояние мембран.

Нарушение переноса кальция через мембраны лимфоцитов было выявлено при бронхиальной астме и других пульмонологических заболеваниях с помощью зонда тетрациклина. С помощью (3-метоксибензантрон) и пирена различали популяции Т- и В-лимфоцитов, а также субпопуляции Т-лимфоцитов при бронхиальной астме. Выявлено снижение интенсивности флуоресценции зонда в лимфоцитах в разной степени в зависимости от формы заболевания. Данный тест позволил также оценить характер терапевтических воздействий. Акридиновый оранжевый эффективно применялся для оценки стадии аллергического процесса и определения чувствительности человека к конкретному антигену.

Для исследования злокачественных новообразований применялись такие зонды, как тетрациклин, флуоресцеин, риодипин. Высокая чувствительность флуоресцентного метода была продемонстрирована в определении ингибиторов холинэстеразы. Авторами оценивалась интенсивность флуоресценции комплекса обратимого ингибитора-флуорофора – этидиум бромида с бутирилхолинэстеразой в присутствии ингибитора такрина. Определение активности холинэстеразы широко используется при разработке лекарственных препаратов для лечения болезни Альцгеймера, контроля содержания фосфорорганических пестицидов, обладающих антихолинэстеразным действием в воде и пищевых продуктах.

Одним из используемых в медицине методов является флуоресцентный метод определения эффективной концентрации альбумина в крови. Альбумин в крови выполняет функцию связывания и транспорта к органам и тканям различных веществ, таких как билирубин, жирные кислоты, стероидные гормоны, производные аминокислот, лекарственные препараты, ксенобиотики и др. Известно, что нарушение связывающей способности альбумина является причиной различных патологических процессов. В основе данного флуоресцентного метода лежит использование специального флуоресцентного красителя – N-карбоксифенилимида диметиламинонафталевой кислоты (К-35), интенсивность флуоресценции которого в сыворотке (плазме) крови пропорциональна числу свободных центров связывания молекулы альбумина. Эта величина значительно снижается при многих заболеваниях, но особенно сильно – при печеночной недостаточности. Выявлено также существенное снижение этих показателей при клинической характеристике эндогенной интоксикации при острых вирусных гепатитах и оценено влияние сопутствующих заболеваний на флуоресцентные показатели.

Были проведены также исследования флуоресцентных показателей для определения общей и эффективной концентрации альбумина в сыворотке и выпоте брюшной полости у больных перитонитом, которые выявили изменения данных показателей в динамике заболевания как в выпоте, так и в сыворотке. По результатам исследования сделан вывод о снижении концентрации альбумина в крови и выходе его в экссудат в измененном состоянии. Аналогичным методом был проведен сравнительный анализ альбумина и других клинико-лабораторных показателей при гнойном перитоните. Показано значительное уменьшение флуоресцентных показателей связывающей способности альбумина и увеличение индекса токсичности. Причем в большинстве случаев данные флуоресцентного анализа во многом превосходили общепринятые клинико-лабораторные тесты при оценке тяжести состояния больного и по прогнозу развития заболевания.

Прогностическая ценность альбуминового флуоресцентного теста была также подтверждена оценкой исхода острых отравлений психотропными средствами.

Свойства связывающих центров молекулы альбумина изучены у больных тревожной депрессией. С целью более детального исследования кроме флуоресцентного теста на альбумин применяли метод тушения флуоресценции зонда К-35 ионами нитрата. Выявлено достоверное уменьшение константы тушения флуоресценции и его доли, доступной тушению, в сыворотке больных по сравнению с контрольной группой, что свидетельствует о значительных изменениях в связывающих центрах альбумина при данной патологии.

Установлено также нарушение микровязкости липидного бислоя при окислении диамидом белков мембран эритроцитов.

Повышение структурированности зоны аннулярных липидов и снижение полярности липидного бислоя выявлено при изучении мембран эритроцитов при воздействии перфтораном, обладающим кислородтранспортной функцией [2].

1.2. Термолюминесцентный метод

Термолюминесценция - это избыток «холодного» света в свечении нагретого непроводящего твердого тела. Она вызывается радиационными нарушениями, накопленными в кристаллической решетке. Ее интенсивность зависит от дозы облучения и таким образом, представляет собой инструмент для определения возраста. Роберт Бойль наблюдал термолюминесценцию более 300 лет назад, около 100 лет назад Видсман и Шмидт обнаружили, что термолюминесценция вызывается ионизирующим излучением. Идея использования минералов в качестве естественных термолюминесцентных дозиметров для определения их возраста принадлежит Дэниелсу и другим.

Термолюминесцентное датирование, является наиболее известным и наиболее развитым методом. Первыми археологическими материалами, на которых был проверен новый метод, были керамика и кирпичи. С тех пор этот метод утвердился в области археологии и геологии. В течение 1960-х и 1970-х годов его главным применением было датирование керамики. Как только стало очевидно, что эта методика подходит также для определения возраста осадков, термолюминесцентный метод в 1980-е получил дополнительный стимул для развития. Состояние исследований в середине 1980-х всесторонне описано Айткеном.

Термолюминесцентное датирование покрывает широкий возрастной диапазон от нескольких сотен до примерно I млн. лет. Это позволяет делать временные оценки довольно разных событий. Для таких объектов, как пещерные натечные образования, металлургические шлаки, вулканический материал, данный метод датирует их кристаллизацию и затвердевание, то есть, событие их формирования. В случае нагретых и обработанных огнем объектов типа керамики, кирпичей, каминов, каменных орудий и обожженных контактов датируется последний случай нагревания.

Оптическое отбеливание сигнала термолюминесценции позволяет датировать эоловые и речные отложения, которые подвергаются действию дневного света во время транспортировки и осаждения.

Несмотря на то, что термолюминесцентный метод уже в значительной степени развит и многократно успешно применялся, его нельзя признать рутинным. Остается потребность в фундаментальных исследованиях, особенно для больших возрастов, направленных на улучшение точности. Погрешность определения возраста достигает в большинстве случаев приблизительно 10%, но в отдельных случаях может быть значительно уменьшена. Термолюминесцентый метод способен конкурировать по точности с радиоуглеродным.

Для термолюминесценции необходимо существование дефектов в кристалле. Эти дефекты служат ловушками для положительных и отрицательных зарядов, возникающих под действием ионизирующего излучения в атомах структурной решетки. Таким образом, во время облучения твердое тело кроме тепловой энергии может принимать и сохранять лучистую энергию. Эта фаза, при которой твердое тело приобретает латентную термолюминесценцию, называют фазой возбуждения. Под действием тепла или света нетепловая часть энергии, содержащаяся в твердом теле, может излучаться в виде люминесценции (фаза стимуляции). В зависимости от типа воздействия на твердое тело различают термолюминесценцию и фотолюминесценцию.

Отдельные фазы, вызывающие явление термолюминесценции, могут быть проиллюстрированы с помощью модели энергетических уровней. В этой модели электрически изолированный кристалл характеризуется занятой валентной зоной и пустой зоной проводимости с энергетически запрещенной зоной между ними. Эта зона населяется дефектами с дефицитом заряда. Ионизирующее излучение отделяет электроны от материнских атомов в валентной зоне и переводит их в зону проводимости. Из зоны проводимости, где они могут свободно диффундировать, большинство электронов быстро возвращаются к основному состоянию, но некоторые из них захватываются в дефектах с дефицитом отрицательного заряда (электронные ловушки). Остающиеся дырки будут пойманы в дефектах кристалла с дефицитом положительного заряда (дырочные ловушки). Захваченные электроны остаются в метастабильном состоянии до тех пор, пока они не будут удалены тепловым возбуждением.

При постепенном нагревании твердых тел последовательно освобождаются ловушки с различной глубиной — сначала мелкие, потом более глубокие. Регистрация интенсивности термолюминесценции излучения как функции температуры нагрева дает кривую свечения.

Таким образом, температурная кривая свечения отражает термическую стабильность высеченных электронных ловушек. Цвет испускаемой термолюминесценции определяется типом центра люминесценции, на котором происходит рекомбинация. Следовательно, спектр термолюминесцентного излучения дает информацию о характере этих центров. Чтобы получить полную информацию о центрах люминесцентного излучения, производится регистрация спектра (рис. 1.1).

Термическая и оптическая стабильность. Если твердое тело с занятыми электронными ловушками, способное испускать термолюминесцентное излучение, подвергнуть нагреванию или освещению, некоторая часть электронов, в зависимости от уровня активации, может покинуть свои ловушки. Латентный сигнал термолюминесценции частично или полностью пропадает. В принципе этот эффект желателен, так как это ведет к переустановке термолюминесцентной системы и, следовательно, создает предпосылку для датирования событий нагрева или отбеливания сигнала. С другой стороны, это может ослабить термолюминесцентный сигнал слишком сильно, приводя к слишком молодым значениям термолюминесцентного возраста. Сигнал термолюминесценции стирается при достаточно продолжительном и/или интенсивном нагревании. Отжиг сигнала термолюминесценции подчиняется законам кинетики. Сигнал термолюминесцентный, появляющийся при заданной температуре кривой свечения, может быть охарактеризован в соответствии со своей термической стабильностью через удельную энергию активации и частотный коэффициент, которые выводятся из результатов эксперимента. Из этих параметров для данной температуры можно получить соответствующее среднее время жизни. Одного часа отжига при температуре 500⁰С достаточно, чтобы полностью перезапустить (обнулить) термолюминесцентную систему. Более низкие температуры отжига воздействуют, соответственно, на более низкочастотные области кривой свечения. Долговременное ослабление сигналов термолюминесценции является главной причиной ограничения сверху возрастного диапазона, поддающегося датировке методом термолюминесценции.

Рис.1.1. Трехмерный термолюминесцентный спектр

Воздействие света, отбеливание, также постепенно ослабляет латентный сигнал термолюминесценции. В отличие от отжига отбеливание полностью не стирает термолюминесцентный сигнал даже при увеличенной продолжительности экспонирования на свету, так что при этом остается неисчезающий остаток. Степень ослабления термолюминесценции зависит от интенсивности света. На солнечном свету отбеливание сигнала термолюминесценции, за исключением неисчезающего остатка, происходит через 10-20 часов. При пасмурной погоде отбеливание дневным светом менее эффективно. Различные термолюминесцентные сигналы от одного и того же минерала обладают различной светочувствительностью.

Явление, имеющее отношение к отбеливанию - термолюминесценция при фотопереносе. Под термолюминесцентным фотопереносом понимается усиление определенных сигналов термолюминесценции после экспонирования на свету. Возможным объяснением этого явления является то, что не все электроны, которые высвобождаются из глубоких ловушек оптическим возбуждением и переходят в зону проводимости, рекомбинируют. Напротив, некоторые из них повторно захватываются, что приводит при последующем тепловом возбуждении к возникновению термолюминесцентого фотопереноса. Предпринимались попытки использовать это явление для датирования керамики, лёсса и речных песков.

Размерные фракции. Обычно для датирования методом термолюминесценции используются тонкозернистые (2-10 мкм) и крупнозернистые (100—200 мкм) фракции. Использование мелкозернистых фракций, которые обычно обладают полиминеральным составом, неудобно из-за неприменимости методов разделения минералов. Однако, применяя методы разделения минералов, можно получить мономинеральные крупнозернистые фракции. У кварца и плагиоклазовых полевых шпатов, содержащих незначительные количества радиоактивных изотопов и, следовательно, получивших только внешнюю дозу облучения, путем травления в плавиковой кислоте удаляют -20 мкм внешней поверхностной корки. Таким образом устраняется внешний, геометрически трудно интерпретируемый α компонент, и поэтому остающееся ядро содержит только внешние β- и γ-фракции мощности дозы. Совершенно иная ситуация возникает в случае с зернами циркона, которые испускают внутреннее β- и γ-излучение, по существу, в окружающую среду и сохраняют только свой α-компонент. Помимо высоких концентраций урана, это дозиметрическое преимущество позволяет датировать цирконы с помощью авторегенерации термолюминесценции, когда сигнал термолюминесценции самовосстанавливается в пределах месяцев после измерения.

Вычисление возраста. Анализ кривых свечения термолюминесценции для определения возраста требует некоторых критериев для выбора пригодных сигналов термолюминесценции. Вызванный облучением сигнал должен быть термически или оптически переустановлен событием, которое должно быть датировано. Этот сигнал должен быть устойчив в течение рассматриваемого промежутка времени. Характеристики роста сигнала не должны отклоняться от математической функции.

На основе этих критериев можно выбрать подходящий сигнал термолюминесценции, если на кривой свечения имеется несколько максимумов. Существенное преимущество можно извлечь, если ограничиться определенными спектральными областями термолюминесцентного испускания, поскольку вышеупомянутые критерии могли бы выполняться только для небольших участков спектра.

Методом термолюминесценции можно датировать различные минеральные фракции и фракции разного размера, полученные из одного и того же образца, например из осадка или из керамического черепка. Так как значения возраста фракций до некоторой степени независимы друг от друга относительно термолюминесцентных характеристик и дозиметрии, их соответствие является важным признаком надежности определения возраста. Хотя при этом потребуются более значительные экспериментальные усилия, желательно принять стратегию отбора проб, при которой предусмотрена возможность определения возраста несколькими методами. Для одного определения возраста термолюминесцентным методом требуется 100 мг выделенного материала образца. Это соответствует начальному весу образца от - 10 г до 1 кг. Помимо собственно измерений термолюминесценции следует подумать о подготовке материала для определения мощности дозы. Оригинальный материал упаковывается в водонепроницаемый материал, так чтобы впоследствии в лаборатории можно было определить его первоначальную влажность. Образцы должны быть защищены от тепла и света, особенно в случае осадков, для которых должно быть датировано последнее освещение. Чтобы устранить любое облучение светом, осадки должны отбираться в тени с применением стальных цилиндров или других типов непрозрачных контейнеров.

В лаборатории образцы при сильно ослабленном освещении разделяются на фракции подходящего размера и минерального состава в соответствии со стандартными методами. Обычно крупнозернистые фракции состоят либо из кварца, различных полевых шпатов, циркона, либо из стекла. Механические напряжения во время дробления образцов иногда могут вызвать триболюминесценцию — нежелательный для датирования тип люминесценции, — которую можно снять отмыванием зерен пробы в разбавленных кислотах. Поскольку термолюминесцентный сигнал стирается при каждом термолюминесцентном измерении, для термолюминесцентного датирования требуется разделение пробы на части. Обычно подготавливается около 50 частей пробы по 1-4 мг каждая. Индивидуальные части пробы (субпробы) помещают на алюминиевые или стальные диски. Подготовка проб к исследованию трудоемка и требует много времени.

Измерительный прибор состоит, по существу, из тарелки, на которой образец нагревают, и фотоумножителя, с помощью которого средствами электроники испускаемый световой сигнал усиливается и регистрируется как функция температуры нагрева. После каждого измерения нагревание повторяется, чтобы зарегистрировать и вычесть фон. Для предотвращения нежелательной хемилюминесценции, которая энергетически подпитывается от экзотермических химических реакций, важно проводить термолюминесцентные измерения в атмосфере очень чистого азота или аргона. Оптические фильтры, которые можно установить между образцом и фотоумножителем, позволяют проводить регистрацию определенных спектральных областей. Автоматизированные и оснащенные компьютерами современные термолюминесцентные приборы позволяют полностью автоматизировать работу и проводить анализ больших серий субпроб [3].

При определении термолюминесценции возраста учитываются различные аспекты эксперимента, такие как выбор типа минерала, зернистости, предварительный подогрев проб, различные скорости нагревания, спектральный диапазон, функции роста, аддитивная или регенеративная методики и отбеливание. Их выбор в значительной степени эмпиричен и пока не оптимизирован и не стандартизован. Различные комбинации этих параметров лежат в основе разнообразных вариантов методики термолюминесцентного датирования, и, следовательно, датирование определенного образца несколькими лабораториями не обязательно даст непосредственно сопоставимые значения термолюминесценции возраста. Поэтому необходимо вместе с данными возраста предоставлять методику эксперимента. Без этой важной информации нельзя оценить результаты измерений. Безусловно, это относится также и к методам определения мощности дозы. Только тогда можно сказать, является ли указанная ошибка определения возраста реальной.

Данный метод характерен для датирования: керамики и обожженной глины, шлаков, вулканических пород, фульгуритов, лесс, остеологических отложений, песков, карбонатов, и других видов материалов.

1.3. Фотолюминесцентный метод

Фотолюминесценция тесно связана с явлением термолюминесценции и также вызывается облучением. Однако, в отличие от термолюминесценции, электроны при этом удаляются из своих ловушек не термически, а оптически. Когда высвобожденные электроны рекомбинируют в центрах люминесценции, испускается свет фотолюминесценции. В соответствии с используемой спектральной областью светового возбуждения говорят о различных фотолюминесцентных методах, а именно фотолюминесценцию с инфракрасным и фотолюминесценцию с зеленым возбуждением. По аналогии с термолюминесценцией, сигнал фотолюминесценции используют для оценки естественной дозы, полученной минералом за время, прошедшее с момента его формирования или последней переустановки хронометрической системы. Это позволяет определить возраст, если известна мощность дозы. Оценка мощности дозы идентична методу термолюминесценции [3].

Из трех дозиметрических методов датирования метод фотолюминесценции был разработан последним. Толчок для использования давно известного явления фотолюминесценции для датирования был дан в работе Хантли и др. Начиная с этого времени были предприняты огромные усилия, чтобы разработать методологию фотолюминесцентного датирования, так как этот метод обладает рядом физических преимуществ по сравнению с термолюминесцентным для датирования отбеленных материалов, главным образом осадков. Фотолюминесцентный метод основан на существовании легко отбеливаемых электронных ловушек, которые освобождаются уже после нескольких минут экспонирования при дневном свете. Таким образом, возникает возможность датировать события, приводящие к слабому экспонированию объекта на свету. Для отбеленного материала метод фотолюминесценции является физически более прямым методом датирования, так как при этом анализируются те же самые ловушки, на которые действовало естественное отбеливание. Еще одним значительным преимуществом метода является почти полная оптическая переустановка сигнала фотолминесценции. Это свойство особенно важно, поскольку позволяет датировать почти современные события (-100 лет). Верхний предел применимости фотолюминесценции должен быть подобен методу термолюминесценции и требует дальнейшего изучения. Фотолюминесцентный метод обещает более высокую точность датирования, чем термолюминесцентный метод.

Фотолюминесцентный метод требует присутствия атомных дефектов в кристаллической решетке, из которых формируются ловушки для электронов, высвобождающихся под действием ионизирующего излучения. Для разъяснения вопросов, связанных с особыми энергетическими уровнями, будем ссылаться на зонную модель.

Заряды захватываются дырочными и электронными ловушками. Среднее время существования этих метастабильных состояний определяется эффективной энергетической глубиной электронных ловушек. Во время оптического возбуждения захваченные электроны активируются так, что они покидают свои ловушки и перемещаются в зону проводимости, где они рекомбинируют с центрами люминесценции с испусканием света. Для возбуждения используются аргоновые лазеры с длиной волны 514.5 км, зеленые светоизлучающие диоды или галогенные и ксеноновые лампы с соответствующими зелеными фильтрами для кварца и циркона, а для полевого шпата диоды инфракрасного света (880 ± 80 им). Чтобы избежать регистрации рассеянного света, сигнал фотолюминесценции измеряют на значительно более коротких длинах волн, чем длины волн возбуждения.

Если интенсивность сигнала фотолюминесценции непосредственно измеряется в процессе возбуждения, с ростом времени экспозиции наблюдается ниспадающая кривая, так называемая кривая спада свечения. Облучение светом с интенсивностью приблизительно 10 мВт/см² в течение нескольких минут вызывает обнуление сигнала фотолюминесценции в кварце и полевых шпатах. Незначительный остаточный сигнал может иметь место из-за темнового тока фотоумножителя, рассеянного света и неотбеленной компоненты фотолюминесценции. Кривая снижения свечения не является простой экспоненциальной функцией распада. Неэкспоненциальный характер кривой может объясняться вкладом ловушек, которые труднее поддаются возбуждению и повторному захвату электрона.

Были исследованы фотолюминесцентные спектры излучения проб различных полевых шпатов и кварца. Спектры испускания фотолюминесценции и термолюминесценции, если они происходят от одного и того же образца, по существу, выглядят весьма похожими, с доминирующими длинами волн для калиевого полевого шпата около 400-420 нм (синий) и 540-600 нм (желтый). Это говорит об участии в этих процессах идентичных центров люминесценции. При исследовании полиминеральных проб с помощью соответствующих фильтров можно разделить, например, инфракрасные фотолюминесцентные спектры испускания ортоклаза (синий/ультрафиолетовый) и плагиоклаза (зеленый).

Кривая спада фотолюминесценции не содержит никакой информации относительно термической стабильности анализируемых электронных ловушек. Это является недостатком по сравнению с кривой свечения термолюминесценции, которая отражает зависимость стабильности высвобождаемых ловушек от увеличения температуры нагрева. Существовавшие поначалу надежды управлять термической стабильностью с помощью длины волны возбуждающего света не оправдались из-за сложности механизмов переноса. При датировании необходимо учитывать факт, что фракция термически нестабильных компонентов сигналов естественной фотолюминесценции через некоторое время подвергается распаду, тогда как недавно индуцированные сигналы фотолюминесценции не несут никаких потерь за счет термически непостоянных компонентов. Это можно сделать, применив методику предварительного подогрева, чтобы уничтожить нестабильные компоненты. Кварц обычно прогревается в течение 16 часов при температуре 160 ⁰С. Нагревание искусственно облученных аликвот в то же самое время приводит к термическому перемещению электронов из поверхностных. Для термически устойчивого сигнала фотолюминесценции кварца среднее время его существования оценивается в 20 млн. лет.

Оптическая чувствительность фотолюминесцентного метода необычайно высока. Под влиянием солнечного света фотолюминесцентный сигнал кварца отбеливается до 1% от его начального значения за 10 секунд, полевого шпата - за 9 минут. Как показали экспериментальные исследования на калиевых полевых шпатах, в пасмурную погоду или под водой времена отбеливания выше из-за более низкой интенсивности света. Инфракрасный фотолюминесцентный сигнал от тонкозернистого лёсса исчезал полностью за 30 минут, если образец подвергался освещению в облачный, туманный, зимний день.

Подобно термолюминесценции, в фотолюминесцентном методе датирования могут использоваться отбеленные пробы, содержащие кварц и полевой шпат. В отличие от термолюминесцентного в этом методе можно также использовать менее интенсивно отбеленные осадки, что делает его особенно привлекательным для датирования подводных отложений. Процедура отбора проб схожа для обоих методов. Так как сигнал фотолюминесценции необычайно чувствителен к световому воздействию, особое внимание следует обратить на то, чтобы не допустить любого облучения светом. Анализируемые профили должны быть защищены от солнечного света во время процедур очистки и отбора проб. Чтобы в значительной степени минимизировать их экспонирование на дневном свету, образцы лучше всего отбирать с помощью стальных цилиндров, которые вбивают в зачищенную поверхность. После выемки цилиндры быстро закрывают плотными стальными крышками.

Подготовку образцов к исследованию в лаборатории следует проводить обязательно при приглушенном свете в специфическом диапазоне длин волн (темная комната). Материал пробы разделяют на мелкозернистую пол и минеральную фракцию и крупнозернистую фракцию, состоящую из кварца или полевого шпата. Обычно готовят 50 аликвот по 1-2 мг и выкладывают их на стальные или алюминиевые тарелки измерения. С одной стороны, тарелки с мелкозернистой фракцией полиминеральных осадков выгодны вследствие лучшей воспроизводимости результатов, с другой стороны, однако, они не допускают разделение образца на различные минеральные фазы. Тем не менее фотолюминесцентное датирование таких отложений без предварительного минерального разделения может быть реализовано с помощью селективного инфракрасного возбуждения фракции полевого шпата, так как кварц, кальцит и циркон не проявляют никакой инфракрасной фотолюминесценции, а возможный инфракрасный фотолюминесцентный вклад амфибола, пироксена и турмалина предположительно незначителен. При использовании крупнозернистой фракции кварц выделяют с помощью тяжелых жидкостей и очищают соляной и плавиковой кислотами. Чистота кварцевой фракции, означающая отсутствие примесей полевого шпата, должна быть проверена отсутствием сигнала. Крупнозернистые фракции полевых шпатов получают разделением в тяжелых жидкостях. Концентраты полевого шпата могут иметь какое-то количество включений кварца, что не будет оказывать существенного влияния на результат, так как сигнал фотолюминесценции полевого шпата обычно в 100 раз более мощный, чем сигнал кварца. Из всех полевых шпатов предпочтителен калиевый полевой шпат из-за его внутреннего вклада в мощность дозы. Следует отметить, что состав полевых шпатов может значительно варьироваться, что в свою очередь может привести к изменению фотолюминесцентных характеристик. Применение соответствующих фильтров позволяет разделить фотолюминесцентное излучение различных полевых шпатов. В отличие от кварца, сигнал фотолюминесценции полевого шпата может обладать аномальным затуханием.

Приборы, разработанные для фотолюминесценции, отличаются друг от друга источниками света для возбуждения. Источниками могут быть ионные аргоновые лазеры, ксеноновые дуговые лампы, кварцевые, галогенные, инфракрасные светодиоды и зеленые светодиоды. Ксеноновые дуговые лампы (1 кВт) и кварцевые галогенные лампы (75 Вт) дают широкий спектр излучения, из которого с помощью фильтров следует выделить желаемую длину волн возбуждения. Кварц требует возбуждения зеленым светом. В большинстве приборов используются как термолюминесцентные, так и фотолюминесцентые измерения. Для инфракрасного возбуждения может использоваться термолюминесцентный прибор, если над нагревательной тарелкой установить кольцо с инфракрасными диодами. Короткие времена возбуждения < 0,1 секунду обеспечиваются применением электронного оптического затвора. Кроме того, аппаратура может быть оборудована источником зеленого света для совместного использования в термолюминесцентных, инфракрасных фотолюминесцентных и зеленых фотолюминесцентных измерениях. При достаточно большой разности между длинами волн света возбуждения и фотолюминесценция излучения использование соответствующих цветных фильтров приведет к тому, что лишь незначительное количество рассеянного света достигнет фотоумножителя. Лазерное возбуждение более трудоемко и в настоящее время редко применяется. Луч аргонового ионного лазера направляют на пробу и измеряют сигнал фотолюминесценции в сине-фиолетовой области спектра (около 380 нм). Разделение света возбуждения и испускания более трудно реализовать при возбуждении зеленым светом, чем при инфракрасном фотолюминесцентном, из-за довольно малой разницы в длинах волн. Интенсивность рассеянного света весьма сильно уменьшается при помощи поглощающих фильтров, вставляемых между образцом и фотоумножителем. Методологические усовершенствования ожидаются от использования селективной, зависящей от длины волны системы регистрации спектров фотолюминесценции с помощью монохроматоров и ПЗС-камер.

Области применения данного метода очень широки, метод применяется для датирования, дюн, лесс, археологических отложений, осиных гнезд, керамики [3].

1.4. Метод макроскопического флуоресцентного анализа

Макроскопический люминесцентный анализ позволяет определить степень микробиологического разложения (фоссилизации) археологического и палеонтологического костного материала, что может иметь решающее значение при отборе материала для биохимических и генетических исследований. Метод основан на способности коллагена к фотолюминесценции - люминесценции инициированной ультрафиолетовым облучением.

Исследование осуществляется следующим образом:

1. В интересующих местах делаются распилы изучаемых костей толщиной 5 – 10 мм.

2. Распилы шлифуются на шлифовальных кругах убывающей зернистости.

3. Распилы и шлифовка проводятся на шлифовальной машине ШМ-1 с использованием отрезных дисков и шлифовальных кругов, применяемых в стоматологии.

4. Проводится цифровая фотосъёмка шлифа при обычном и ультрафиолетовом освещении. Для чего:

4.2. Проводится фокусировка камеры при обычном освещении,

4.3. Проводится блокировка автофокуса,

4.4. Проводится съёмка шлифа при обычном освещении,

4.5. Проводится съёмка шлифа при освещении диагностическим ультрафиолетовым осветителем ОЛД-41 (рис. 1.2).

5. Далее с помощью программы Adobe Photoshop определяется процент сохранности коллагена кости. Для чего:

5.1. С помощью инструмента «Лассо» оконтуривается поперечный срез компактного вещества кости, при этом в контур не включаются проекция боковой поверхности кости, которая может оказаться на фотографии, костный канал и губчатое вещество кости (рис. 1.3).

6. Создание черно-белого изображения.

6.1. В меню «Изображение» выбирается подменю «Настройки» и пункт «Уровни» (рис. 1.4).

6.2. С помощью инструмента “пипетка” в качестве белого цвета выбирается цвет флюоресцирующего коллагена – самый яркий голубой цвет фотографии (рис. 1.5).

6.3. В качестве черного цвета выбирается цвет фоссилизированной (разложившейся) кости в зависимости от конкретной фотографии (рис. 1.6).

6.4. Нажать кнопу <ОК>. Перейти в меню «Изображение», подменю «Режим», пункт «Чёрно-белый» (рис. 1.8).

7. Оценка черно-белого изображения.

7.1. В меню «Изображение» выбирается подменю «Гистограмма» (рис. 1.9).

7.2. На гистограмме считывается показание пункта «Значение» (рис. 1.10.), далее рассматриваемый как «f».

7.3. Учитывая, что значение гистограммы для полностью сохранной кости (белой поверхности) составляет 255 единиц, степень фоссилизации шлифа определяется по формуле: F = 1- f/255 Результат может выражаться как в процентах, так и в десятичных дробях [4].

Рис. 1.2. Поперечный шлиф медиального участка бедренной кости. Съёмка при ультрафиолетовом освещении

Рис.1.3 Оконтуривание при помощи инструмента «Лассо»

Рис. 1.4. Выбор пункта меню «Уровни»

Рис.1.5. Использование инструмента «Пипетка» (выбор белого цвета)

Рис. 1.6. Использование инструмента «Пипетка» (выбор черного цвета)

Рис. 1.7. Результат использования инструмента «Пипетка»

Рис. 1.8. Выбор пункта меню «Чёрно-белый»

Рис. 1.9. Выбор подменю «Гистограмма»

Рис. 1.10. Определения степени фоссилизации длинных трубчатых костей с использованием программы Adobe Photoshop.

Выводы: различают следующие виды люминесцентной диагностики: термолюминесцентный метод, метод атомно-флуоресцентного анализа и фотолюминесцентный метод, современной разновидностью которых является метод макроскопического флуоресцентного анализа.

Термолюминесцентный метод основан на ионизирующем излучении. Термолюминесцентное датирование покрывает широкий возрастной диапазон от нескольких сотен до примерно I млн. лет. Это позволяет делать временные оценки довольно разных событий. Это наиболее известный и развитый метод.

Фотолюминесцентный метод основан на существовании легко отбеливаемых электронных ловушек, которые освобождаются уже после нескольких минут экспонирования при дневном свете. Таким образом, возникает возможность датировать события, приводящие к слабому экспонированию объекта на свету.

Достоинствами метода атомно-флуоресцентного анализа являются сравнительно низкий уровень фона; высокая селективность измерений; малые спектральные помехи, что позволяет детектировать слабые аналитические сигналы и соответственно очень малые абсолютные количества элементов; высокая чувствительность и быстродействие, превышающая чувствительность таких методов, как радиоизотопный и иммуноферментный. Кроме того, методы исследования флуоресценции относятся к неразрушающим, а также не требуют большого объема пробы.

Современной модификацией метода атомно-флуоресцентного анализа и фотолюминесцентного является метод макроскопического флуоресцентного анализа, предложенный доцентом СГМА: Меренковым В. Г. Метод подразумевает использование ультрафиолетового осветителя с последующей регистрацией люминесценции, цифровой фотокамерой и последующей обработкой а так же анализом в программе Adobe Photoshop.

2. СПЕКТРОФЛУОРИМЕТРИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ОСТЕОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ

2.1. Общие сведения о костных тканях

Костная ткань - один из видов соединительной ткани, состоящей из трех видов клеток и обизвествленного межклеточного матрикса.

Клетки составляют »1-2% от всего объема костной ткани, остальной объем занят порами и каналами (для компактной костной ткани пористость составляет 13-18%, для губчатой она выше) и твердой фазой - органическими и минеральными составляющими костных пластинок.

Органическая составляющая (40-50% твердой фазы) представлена коллагеном. Минеральная составляющая (50-60% твердой фазы) - преимущественно кристаллы гидроксилапатита Са₁₀ (РО₄ ) ₆ (ОН)₂ и других солей кальция.

В пределах пластинки коллаген - минеральные волокна ориентированы в определенном направлении и соединены связующим веществом.

2.2. Методика измерений на спектрофлуориметре Флюорат-02-Панорама

Исследование спектров возбуждения и люминесценции. Наиболее полно реализовать измерительные возможности прибора Флюорат-02-Панорама и приборных комплексов на его основе можно только при использовании внешнего компьютера с установленным программным обеспечением (ПО) «Panorama Pro». ПО предназначено для управления спектрофлуориметром при проведении хроматографических, спектрофото- и спектрофлуориметрических, хеми- и биолюминесцентных измерений, а также при определении спектральных характеристик внешних источников излучения.

Математическая обработка результатов измерений осуществляется средствами поставляемого программного обеспечения или иными программными продуктами, для чего предусмотрен экспорт результатов измерения в форматы ASCII и MS Excel.

Для проведения спектральных измерений необходимо выбрать пункт «Спектральные» в меню «Измерения» в окне программы. Рабочее поле в этом случае примет вид, показанный на рис. 2.1.

На вкладке «Измерение» можно выбрать:

· Тип сканирования (по возбуждению, регистрации, синхронное, с переменным углом);

· Параметры сканирования в соответствии с выбранным типом;

· Параметр усреднения;

· Режим математической коррекции;

Возможны следующие типы сканирования: по возбуждению, по регистрации, синхронное и с переменным углом.

При сканировании по возбуждению необходимо для монохроматора возбуждения задать спектральный диапазон (поля «От» и «До») и «Шаг», а для монохроматора регистрации - постоянную длину волны.

При сканировании по регистрации необходимо для монохроматора возбуждения задать постоянную длину волны, а для монохроматора регистрации - спектральный диапазон (поля «От» и «До») и «Шаг».

При синхронном сканировании одновременно изменяется и длина волны возбуждения, и длина волны регистрации. При этом поддерживается постоянное смещение монохроматора регистрации относительно настройки монохроматора

возбуждения.

Величина этого смещения может задаваться либо в нанометрах, либо в обратных сантиметрах. Параметрами сканирования являются спектральный диапазон (поля «От» и «До») и «Шаг» для монохроматора возбуждения, а также величина и единицы смещения для монохроматора регистрации.

При сканировании с «переменным углом» также одновременно изменяется и длина волны возбуждения, и длина волны регистрации. Отличие состоит в том, что шаг перестройки монохроматора регистрации может быть не равным шагу перестройки монохроматора возбуждения.

Параметрами являются спектральный диапазон (поля «От» и «До») и «Шаг» для монохроматора возбуждения и спектральный диапазон (поля «От» и «До») для монохроматора регистрации. «Шаг» монохроматора регистрации вычисляется путем деления диапазона сканирования на количество шагов монохроматора возбуждения.

Параметр усреднения задает количество элементарных измерений (вспышек лампы), результат которых будет усредняться для вывода одной точки графика. С увеличением параметра усреднения уменьшается уровень шума, но растет полное время сканирования.

Построение трехмерных графиков (двумерное сканирование). Двумерное сканирование позволяет получить полную информацию о люминесценции изучаемого объекта. Длины волн монохроматоров возбуждения и регистрации изменяются независимо друг от друга с заданным шагом, образуя сетку точек на плоскости. Интенсивность люминесценции измеряется в каждой точке сетки и представляется в виде поверхности в трехмерном пространстве. Для проведения измерений необходимо выбрать пункт «Двумерное Сканирование» в меню «Измерения» (рис. 2.2). Главным отличием этого окна от окон других измерений является наличие двух областей отображения графической информации. В левой части находится обычный двумерный график, на котором отображается результат одного прохода сканирования «быстрого» монохроматора. В правой части отображается полный результат в виде проекции трехмерной поверхности.

На вкладке «Измерение» рабочей панели можно выбрать:

· Тип сканирования,

· Параметры области сканирования,

· Параметр усреднения,

· Параметр сглаживания,

· Режим математической коррекции,

· Угол поворота трехмерного графика относительно вертикальной оси.

Тип сканирования определяет, какой из монохроматоров является «быстрым», т.е. осуществляет сканирование в заданном диапазоне при фиксированном положении другого («медленного») монохроматора.

Область сканирования задается путем задания интервалов сканирования (поля «От», «До» и «Шаг») для каждого из монохроматоров. Для медленного монохроматора значение поля «От» может быть больше значения поля «До», что приводит к сканированию от больших длин волн к меньшим, полезному при исследовании веществ, нестойких к воздействию жесткого ультрафиолетового излучения.

Из области сканирования можно исключить стоксову область (λ_рег > λ_возб, флажок Стокс), антистоксову область (λ_рег < λ_возб, флажок Анти-Стокс) и запретную зону – область, для которой |λ_рег – λ_возб| < Δ_запр. В запретной зоне пересекаются крылья спектрального пропускания монохроматоров возбуждения и излучения.

Из области сканирования можно исключить стоксову область регистрации, что для мутных или рассеивающих растворов приводит к большим ложным сигналам и может вызвать зашкаливание в канале люминесценции.

Сглаживание позволяет уменьшить уровень шума сигнала без увеличения параметра усреднения и, таким образом, позволяет существенно уменьшить время измерения. Параметр сглаживания задает ширину окна двойного кубического сглаживания, нулевое значение соответствует отсутствию сглаживания. Изменять параметр сглаживания можно в любой момент до начала, в процессе или после завершения измерения. Угол поворота определяет способ построения проекции трехмерной поверхности на плоскость экрана.

Для изменения угла (вращения графика) можно воспользоваться одним из следующих способов: Для запуска измерений следует нажать кнопку «Старт». Данные, получаемые во время одного прохода сканирования «быстрого» монохроматора показываются обычным образом на двумерном графике (в не сглаженном виде). По завершении прохода полученный спектр сглаживается и добавляется на трехмерный график.

По завершении измерения щелчком левой кнопки мыши по линии на трехмерной поверхности можно просмотреть соответствующий спектр на двумерном графике. Выделенная таким образом линия показывается красным цветом.

Параметры прибора (чувствительность ФЭУ, задержка и длительность строба), с которыми производилось измерение, запоминаются в файле результатов. Для их просмотра предусмотрена вкладка Параметры.

При необходимости повторить измерение с теми же самыми значениями параметров можно воспользоваться кнопкой «Установить».

При нажатии правой кнопки мыши в области трехмерного графика появляется контекстное меню, содержащее пункты:

· Копировать таблицу – скопировать данные в буфер обмена Windows в текстовом формате. Эти данные можно вставить в текстовый документ или электронную таблицу.

· Копировать график – скопировать данные в буфер обмена Windows в графическом формате.

· Поиск максимума – поиск абсолютного максимума на трехмерной поверхности. Спектр, которому принадлежит максимум, показывается на двумерном графике, а на точке максимума устанавливается маркер.

2.3. Результаты измерений

Исследования проводились с помощью спектрофлуориметра «Флюорат-02-Панорама» с выставлением соответствующих настроек в программном обеспечении «Panorama Pro». Костный шлиф устанавливался на торец волоконного световода, закрывался крышкой, внутренняя поверхность которого покрыта черным бархатным материалом. Исключали внешние помехи: солнечный свет и излучение ламп.

Для анализа спектров слуховых косточек необходимо выполнить 3 последовательных измерений:

Рис. 2.3. Волоконный световод на подставке

Рис. 2.4. Установка костного шлифа на торец световода

Рис. 2.4. Крышка для исключения внешних засветок

Для анализа спектров слуховых косточек необходимо выполнить 3 последовательных измерений:

1. Спектр возбуждения слуховой косточки при синхронном сканировании;

2. Спектр люминесценции слуховой косточки;

3. Спектр возбуждения слуховой косточки;

На рис. 2.5 представлены спектры возбуждения при синхронном сканировании 8 образцов слуховых косточек, диапазоне длин от 180 нм до 540 нм.

Рис. 2.5. Спектры возбуждения при синхронном сканировании 8 образцов слуховых косточек:

1 – спектр образца №1; 2 – спектр образца №2; 3 – спектр образца №3; 4 – спектр образца №4; 5 – спектр образца №5; 6 – спектр образца №6; 7 – спектр образца №7; 8 – спектр образца №8

На рис. 2.6 представлен спектр возбуждения при синхронном сканировании слуховой косточки под номером 7.

Рис. 2.6. Спектр возбуждения при синхронном сканировании слуховой косточки номер 7

Из рис. 2.6 видно, что спектр возбуждения слуховой косточки номер 7 находится в диапазоне от 230 нм до 500 нм.

Спектр возбуждения имеет 3 пика, находящихся на длинах волн 364 нм, 393 нм, 425 нм. Как показали исследования, пик с длиной волны 352 нм – ложный и связан с шумами прибора.

Двумерные спектры возбуждения и люминесценции слуховой косточки номер 7 приведены соответственно на рис. 2.7. и 2.8.

Рис. 2.7. Двумерный спектр возбуждения слуховой косточки

Рис.2.8. Двумерный спектр люминесценции слуховой косточки

Рис. 2.9. Спектр возбуждения косного шлифа 13б при синхронном сканировании

Из рис. 2.9. видно, что спектр возбуждения костного шлифа имеет 2 максимума: на длине волны 360 нм и 420 нм.

Рис. 2.10. Спектр люминесценции шлифа в рабочем диапазоне

На рис. 2.10 изображены 2 спектра люминесценции шлифа, максимумы которых лежат на интервалах длин волн 420-435 нм и 475-500 нм.

Рис. 2.11. Спектр возбуждения шлифа 13б для длины волны люминесценции 426 нм

Спектр возбуждения имеет максимум на длине волны 361нм

Рис. 2.12. Спектр возбуждения шлифа для длины волны люминесценции 486 нм

Спектр возбуждения не имеет ярко выраженного пика, и максимален на интервале длин волн 420-425 нм.

Рис. 2.13. Спектр возбуждения шлифа Р6П42 при синхронном сканировании

Из рис. 2.13 видно, что спектр возбуждения костного шлифа имеет 2 максимума: на длине волны 360 нм и 425 нм.

Рис. 2.14. Спектр люминесценции шлифа Р6П42 при возбуждении длиной волны 360 нм

Рис. 2.15. Спектр люминесценции шлифа Р6П42 при возбуждении длиной волны 425 нм

На рис. 2.14 и рис. 2.15 изображены 2 спектра люминесценции шлифа, максимумы которых лежат на интервалах длин волн 435-460 нм и 475-500 нм.

На рис. 2.16 и рис. 2.17 изображены спектры возбуждения шлифа.

Рис. 2.16. Спектр возбуждения шлифа

Из рис. 2.16 видно, что спектр возбуждения шлифа имеет максимум в широком диапазоне длин волны 360-390 нм

Рис. 2.17. Спектр возбуждения шлифа

По рис. 2.17 определили, что спектр возбуждения имеет выраженный максимум на длине волны 422 нм.

Двумерный спектр возбуждения шлифа представлен на рис. 2.18.

Рис. 2.18. Двумерный спектр возбуждения шлифа

Двумерный спектр люминесценции шлифа приведен на рис. 2.19

Рис. 2.19. Двумерный спектр люминесценции шлифа

Выводы: разработанная методика анализа костных шлифов на спектрофлуориметре «Панорама» является более информативной по отношению к макроскопическому анализу. Она позволяет получать спектры возбуждения и люминесценции образцов и на основе полученных данных проводить более глубокий анализ. Как показали исследования, слуховые косточки имеют спектр люминесценции с пиками в диапазоне длин волн 364-425 нм, шлифы имеют 2 спектра люминесценции (13б, Р6П42) в диапазоне длин волн 420-460 нм и 475-515 нм, возбуждающиеся на 360-390 нм и 420-425 нм.

3. КИНЕТИКА ЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ОСТЕОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ

3.1. Методика измерений кинетики люминесценции

Спектрофлуориметр «Панорама» позволяет проводить измерения интенсивности сигнала люминесценции от времени в микросекундном диапазоне – кинетики люминесценции. Для этого необходимо выбрать пункт «Кинетика люминесценции» в меню «Измерения». В результате на рабочей панели во вкладке «Измерение» нужно будет задать:

· Тип сканирования;

· Параметры сканирования в соответствии с выбранным типом;

· Параметр усреднения;

· Режим математической коррекции.

Возможны два типа сканирования: по задержке и по длительности измерительного строба. В первом случае измеряется непосредственно зависимость интенсивности от времени, во втором – интеграл по времени.

При сканировании по задержке необходимо задать диапазон (поля «От» и «До») и «Шаг» изменения задержки, а также постоянную величину длительности.

При сканировании по длительности необходимо задать постоянную величину задержки и диапазон (поля «От» и «До») и «Шаг» изменения длительности.

3.2. Результаты измерений кинетики в люминесценции

Для измерения кинетики во вкладке «Измерения» выбираем «Кинетика», далее «По длительности», либо «По задержке». Установим длину волны возбуждения 425 нм, длину волны регистрации 530 нм.

Чувствительность ФЭУ высокая, усреднение по 25 точкам диапазон 0,05-20 мкс с точностью 0,05 мкс.

Кинетика костного шлифа К-5 по задержке приведена на рис. 3.1.

Из полученных результатов можно сделать вывод: максимально время затухания люминисценции у костного шлифа tзат=4,2 мкс.

Рис. 3.1. Кинетика люминесценции шлифа К-5 (сканирование по задержке)

Рис. 3.2. Кинетика люминесценции шлифа К-5 (сканирование по длительности)

Кинетика костного шлифа P6 П42 по задержке приведена на рис. 3.3

Из полученных результатов можно сделать вывод: максимально время затухания люминисценции у костного шлифа tзат=4,8 мкс

На рис. 3.5 представлена кинетика люминесценции 3 образцов слуховых косточек (сканирование по длительности)

Рис. 3.3. Кинетика люминесценции костного шлифа P6 П42 (сканирование по задержке)

Рис. 3.4. Кинетика люминесценции костного шлифа P6П42 (сканирование по длительности)

Проанализировав полученные результаты измерения интенсивности люминисценции 3 образов слуховых косточек в зависимости от длительности импульса возбуждения, можно сделать вывод, что максимальный сигнал кинетики люминесценции слуховых косточек отличается: для образца номер 1 ,для обзазца номер 2 , а для номер образца 3

Рис. 3.5. Кинетика люминесценции 3 образцов слуховых косточек (сканирование по длительности): 1 – спектр слуховой косточки №1; 2 – спектр слуховой косточки №2; 3 – спектр слуховой косточки №3

Рис. 3.6. Кинетика люминесценции шлифа 13б (сканирование по задержке)

На рис. 3.6 представлена кривая, полученная при измерении кинетики люминесценции по задержке костного шлифа 13б. По графику видно: сигнал максимален от 0 до 1 мкс, затем начинает значительно падать до 4 мкс, далее падает медленнее и с 17 мкс стремится к 0.

Выводы: по полученным результатам при измерении кинетики по длительности и кинетики по задержке , можно сказать, графики костных шлифов К-5 и P6 П42 достаточно схожие, а у 3 образцов слуховых косточек максимальные сигналы кинетики люминесценции заметно отличаются друг от друга.

ПРИЛОЖЕНИЯ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Оптические методы исследования биоструктур (тканей, клеток, белков) основаны на использовании законов оптики, касающихся природы, распространения и взаимодействия с веществом электромагнитного излучения оптического диапазона (видимый свет, ультрафиолетовое и инфракрасное излучение).

Все основные биохимические и клеточные компоненты тканей и крови обладают характерными «индивидуальными» спектрами поглощения, отражения, рассеяния и люминесценции. Эти спектры различны для разных мягких тканей и областей уплотнений в них, для окисленного и восстановленного состояния молекул в клетках ткани. Общее же процентное соотношение разных биохимических и анатомо-морфологических компонент в тканях различно для состояния нормы и заболевания органов и систем организма. Следовательно, общее функциональное и патофизиологическое состояние тканей отражается на их общих оптических свойствах, которые могут быть зарегистрированы методами люминесцентного анализа.

Среди современных оптических методов исследования биологических тканей особое место занимают методы флуоресцентной спектроскопии. Флуоресценция биоткани несёт информацию о концентрации и пространственном распределении её хромофоров и флуорофоров, что позволяет судить о структуре биоткани, об интенсивности происходящих в ней метаболических процессов и др.

Спектры флуоресценции часто дают детальную информацию о флуоресцирующих молекулах, их конформациях, комплексах, местах связывания и взаимодействиях с клетками и тканями.

Проведен флуоресцентный анализ слуховых косточек. Он позволяет определить степень микробиологического разложения (фоссилизации) костного материала.

Спектры флуоресценции часто дают детальную информацию о флуоресцирующих молекулах, их конформациях, комплексах, местах связывания и взаимодействиях с клетками и тканями

Современной модификацией фотолюминесцентного метода является метод макроскопического флуорисцентного анализа, предложенный доцентом СГМА: Меренковым В.Г. Метод подразумевает использование ультрафиолетового осветителя с последующей регистрацией люминесценции, цифровой фотокамерой и последующей обработкой, а так же анализом в программе Adobe photoshop.

Измерения люминесценции костных шлифов в работе проводились на спектрофлуориметре Флюорат-02-Панорама. В совокупности с внешним компьютером и установленным программным обеспечением «Panorama Pro» российский прибор открывает широкие возможности для анализа и диагностики биообъектов, жидких и газообразных проб, неорганических образцов, а также позволяет проводить первичную обработку результатов измерений, сравнительный анализ, сложные математические операции над спектрами и временными зависимостями. Это позволяет значительно упростить и ускорить процесс диагностики, а также разработать комплексные методики анализа различных веществ и объектов на основе данного прибора.

Методика комплексного анализа костных шлифов на спектрофлуориметре Флюорат-02-Панорама включает в себя семь последовательных измерений: спектра возбуждения образца при синхронном сканировании, спектров люминесценции и возбуждения, двумерных спектров возбуждения и люминесценции, кинетики люминесценции.

Как показали исследования, шлифы могут иметь один спектр люминесценции (1С, П25) с пиком в области 484-502 нм с длинной волны возбуждения 422-425 нм, 2 спектра люминесценции (К5, 13б, Р6П42) в диапазоне длин волн 420-460 нм и 475-515 нм, возбуждающиеся на 360-390 нм и 420-425 нм соответственно, и шлифы не люминесцирующие (4П-22, 14П-16).

Можно предположить, что во всех люминесцирующих шлифах люминесцирует с пиком в области 475-515 нм и возбуждается с длинной волны 420-460 нм одно и то же вещество.

Как показали исследования кинетика люминесценции, графики костных шлифов К-5 и P6 П42 достаточно схожие, а у 3 образцов слуховых косточек максимальные сигналы кинетики люминесценции заметно отличаются друг от друга.

В работе проводились исследования шлифов костных тканей из остеологических материалов, полученных при археологических раскопках на территории г. Смоленска и из анатомического музея Смоленской государственной медицинской академии. Возраст костей составляет более 1000 лет.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Медицинский портал «ДокторКлуб+ру» //Люминесцентный анализ [Электронный ресурс].

– Режим доступа: http://doctorclub.ru/enc/569. Дата обращения: 25.04.2014.

2. Иванова С.В. Использование флуоресцентных методов в медицине [Текст]

/ С.В. Иванова, Л.Н. Кирпичёнок // Медицинские новости. – 2008. – № 12. – С. 56-61.

3. Вагнер Г. Научные методы датировки. [Текст] / 2006 – 352 с.

4. Меренков В.Г. Остеологическим мониторинг археологических исследований. [Текст]

/ 2008 – 10 c.

5. Бабурченков М.А., Бондарева Т.М., Юлин В.С. Исследование спектров люминесценции

слуховых косточек [Текст] / Вестник СГМА 2014, специальный выпуск. – 2014 – С. 4-6.

6. Бондарева Т.М. Оптические методы диагностики в археологии // Математическая

морфология: Электронный математический и медико-биологический журнал. − Т. 12.

− 2013. − Вып. 2 [Электронный ресурс] URL: http://www.smolensk.ru/user/sgma/

MMORPH/N-38-html/bondareva/bondareva.htm. Дата обращения: 29.04.2014.

7. Бабурченков М.А. Люминесценция шлифов костных тканей // Математическая

морфология: Электронный математический и медико-биологический журнал. − Т. 12.

− 2013. − Вып. 2 [Электронный ресурс] URL: http://www.smolensk.ru/user/sgma/

MMORPH/N-38-html/baburchenkov/baburchenkov.htm. Дата обращения: 15.05.2014.

Поступила в редакцию 19.06.2014.