УДК: 611.831.91:611.018

Основными преимуществами метода лектиновой гистохимии в сравнении с традиционными методиками гистохимии углеводов, является высокая чувствительность и селективность, возможность применения для прижизненных исследований тканевых структур и использования как на ультраструктурном, так и на клеточном и тканевом уровнях.

Существует определенная аналогия между методами лектиногистохимии и иммуногистохимии. Так, гистохимические методы с использованием антител и лектинов обладают примерно одинаковой чувствительностью, сходны механизмы протекания гистохимических реакций и принципы визуализации мест связывания лектинов и антител в тканях. В отличие от антител лектины взаимодействуют только с углеводными детерминантами биополимеров; специфичность лектинов несколько ниже таковой антител. Вместе с тем, гистохимические методы с применением лектинов по чувствительности и селективности выявления отдельных типов и субпопуляций клеток не уступают иммуногистохимическим методам и превосходят таковые, основанные на определении активности специфических ферментов [1, 2, 3, 4].

Функциональная специализация рецепторов различных лектинов, признаком которой является экспрессия одних, маскирование или интернализация рецепторов других в процессе реализации межклеточных взаимодействий в конкретных условиях, возникающих на том или ином этапе онтогенеза. Так, поверхностные гликоконьюгаты с концевыми остатками D–галактозы чаще всего появляются в те моменты онтогенеза, когда взаимодействие между клеточными системами требуют высокой степени сродства (авидности) реагирующих макромолекул. c гликополимерами, содержащими концевые остатки D–галактозы связаны молекулярные механизмы межклеточной адгезии [5, 6, 7, 8].

Цель настоящего исследования заключалась в сравнении характера и различий распределения активности к рецепторам галактозоспецифичным лектинам между структурными компонентами чувствительных ганглиев у половозрелых крыс.

Работа выполнена на 26 белых беспородных белых крысах–самцах 6–ти месячного возраста. Объектом исследования явились каудальные узлы блуждающих нервов (КУБН) и узлы тройничного нерва (УТН).

Перед эвтаназией, животных наркотизировали внутрибрюшинным введением тиопенталнатрия (40 мг/кг) и перфузировали через левый желудочек 100 мл изотонического раствора NaCl. Фиксацию материала проводили в 4% растворе нейтрального формалина в 2 этапа: 1) введением in situ через левый желудочек 100 мл фиксирующего раствора; 2) дофиксация материала в том же фиксирующем растворе в течении 3–х суток. Далее заливка объектов в парафин по общепринятой методике. Депарафинированные срезы, толщиной 3–5 мкм обрабатывали коньюгатами лектинов клещевины и омелы белой с пероксидазой хрена (в соответствии с рекомендациями [9]. Проявление активности пероксидазы хрена осуществляли по методу Graham R. C., Karnovsky M. J. [10], Ход реакции контролировался визуально с помощью микроскопа, по интенсивности окраски тканевых структур. Реакцию останавливали погружением срезов в забуференный изотонический раствор. Далее заключение препаратов в канадский бальзам по общепринятой методике. Параллельно проводили контроль специфичности гистохимических реакций. Произведена компьютерная обработка исходных гистологических препаратов с использованием програмнотехнологического комплекса “Bioscan” (СП “Конако”, Минск) и пакета прикладных статистических программ “Biotest”. Оценивались следующие параметры нейроцитов: метрический – ДЭК – диаметр эквивалентного круга (диаметр эквивалентного круга, площадь которого равна площади объекта. Измеряется в мкм); оптические – СВЯ – средняя величина яркости (уровня серого) в объекте (абсолютно черный объект имеет нулевую яркость, при появлении серых тонов значение параметра возрастает. Программа поддерживает 64 уровня яркости. Измеряется в относительных единицах); ИОП – интегральная оптическая плотность (параметр используется для оценки объема вещества. Измеряется в относительных единицах.) Оценивались ядерно–цитоплазматические отношения по оптическому параметру (СВЯ), распределение клеток по степени накопления нейроплазмой продукта гистохимической реакции (параметр ИОП) и наличие корреляции между размерами нейроцитов и количеством накопления лектин–положительного материала (параметры ДЭК и ИОП).

Установлено, что в КУБН галактозспецифичные лектины обнаруживают сходный характер связывания. На фоне слабо прокрашенной соединительнотканной стромы узла с хорошо заметными периневральными клетками лежат темные перикарионы с четкими границами и зернистым распределением лектин–положительного материала в нейроплазме. Ядра определяются плохо или имеют размытые границы и выглядят как более светлые по отношению к перикариону нуклеальные зоны.

Повышенную тропность к миелиновым волокнам имеют лектин клещевины, к глиальным элементам – лектин омелы белой. На срезах, обработанных данными лектинами в соединительнотканной капсуле отчетливо определяются базальная мембрана. Клетки глии выглядят на срезах, обработанных этими лектинами, более интенсивно окрашенными, чем нейроциты.

В УТН рецепторы к лектину клещевины встречаются во всех структурных компонентах узлов. Интенсивно прокрашивается соединительнотканная капсула узлов, четко выявляются ядра соединительной ткани. Границы нейроцитов хорошо выражены, продукт гистохимической реакции в перикарионе выявляется в виде четко оформленных гранул. Ядра большинства нейроцитов светлые, иногда встречаются слабо прокрашенные ядрышки.

Характер распределения рецепторов к лектину омелы белой совпадает как для структурных компонентов КУБН так и УТН. Всегда прокрашивается капсула узла, метятся ядра соединительной ткани. Клетки, формирующие микроглию, как и границы нейроцитов выявляются недостаточно четко. Продукт гистохимической реакции локализуется в перикарионе либо в форме четко оформленных гранул (характерно для лектина из омелы белой), либо равномерно распределен в перикарионе (характерно для лектина клещевины).

При компьютерном видеоанализе морфологических препаратов выявлено, что для более реактивной нейроплазмы показатель средней величины яркости оказывается более низким (темная окраска), для ареактивной нуклеальной зоны значение параметра несколько выше (светлая окраска). Однако, следует отметить тот факт, что для данных лектинов, отличающихся хорошей избирательностью связывания с компартментами клеток значения данного параметра нуклеальной и перинуклеальной зон имеют заметные отличия и носят достоверный характер (р<0,05). Корреляционный анализ между метрическими параметрами и параметром интегральная оптическая плотность, позволил выявить в составе афферентных гаглиев популяции клеток, имеющие наибольшую тропность к изученным лектинам. Так установлено, что в КУБН наибольшую авидность к лектину клещевины имеют нейроциты с метрическими параметрами 13,61–17,85 мкм (r=0,75), к лектину из омелы белой – мелкие клетки с ДЭК менее 17,82 мкм (r=0,68). Для нейроцитов УТН наибольшую тропность к лектину клещевины имеют нейроциты с ДЭК 15,77 – 25,34 мкм (r=0,81), а для лектина из омелы белой 18,36 – 27,63 мкм (r=0,63). Следует отметить, что корреляция между оптическими и метрическими параметрами, во всех исследуемых случаях носит непрямой характер.

Отчетливая избирательности связывания лектинов со структурами афферентных узлов и компартментами клеток у взрослых крыс может указывать на высокую степень дифференцировки структур ганглиев и приобретение ими индивидуальных биохимических особенностей. В связи с этим топография поверхностных гликоконъюгатов для каждой структуры приобретает свои характерные особенности. При этом для галактозоспецифичных лектинов клещевины и омелы белой рецепторы которых, как было установлено, имеют сходную топографию у половозрелых крыс, наиболее характерно связывание с мембранными структурами – об этом говорят четко прокрашенные мембраны клеток и гранулярный характер распределения продукта гистохимической реакции в нейроплазме (связывание идет преимущественно не матриксом цитоплазмы, а с мембранными органоидами нейроцита). Описанная различными авторами способность лектина клещевины маркировать миелиновые волокна, а лектина омелы белой – глиальные элементы, подтвердилась и в нашем исследовании [11, 12, 13].

Представляется весьма вероятным, что возникшая в ходе эволюции специализация рецепторов лектинов основана на различной интенсивности межмолекулярных взаимодействий концевых моносахаридных остатков D–галактозы, N–ацетил–D–галактозамина, N–ацетил–D–глюкозамина, L–фукозы, N–ацетилнейраминовой кислоты и активных центров соответствующих эндогенных лектинов тканей человека и животных.

Лектин–рецепторные системы в процессе гисто– и морфогенеза играют важную роль, их функции заключаются в регулировании агрегационно–миграционных характеристик клеток, их дифференциации, формировании структурных и функциональных контактов между отдельными клеточными системами.

Применение современных методов визуализации и обработки изображений, в частности использование компьютерного видеоанализа морфологических препаратов, позволяет выявлять популяции и субпопуляции нейроцитов в составе афферентных ганглиев, не выявляемые при использовании обычных методов в морфологических исследованиях.

1. Gaucher D., Chadee K. //Arch. Med. Res. – 2000.– Vol. 4. – P.307–308.
2. Freitas M., Cayuela C., Antoine J. M., Piller F., Sapin C., Trugnan G. //Сell Microbiol. – 2001. – Vol. 3. – N. 5. – P. 289–300.
3. Salazar I., Sanchez Quinteiro P., Lombardero M., Cifuentes J.M. // Chem. Senses. – 2001. – Vol. 26. – N. 6. – P. 645–652.
4. Wallis G. L., Easton R. L., Jolly K., Hemming F. W., Peberdy J. F. //Eur. J. Biochem. – 2001. – Vol. 268. – N. 15. – P. 4134–4143.
5. Franceschini V., Lazzari M., Ciani F. //Anat. Embryol. (Berl.). – 2000. – Vol. 202. – N. 1. – P. 49–54.
6. Pillai D. R., Kobayashi S., Kain K. C. //Arch. Med. Res. – 2000. – Vol. 31. – N. 4. – P. 234–236.
7. Pacheco–Yepez J., Shibayama M., Campos–Rodriguez R., Petri W. A., Tsutsumi V. //Arch. Med. Res. – 2000. – Vol. 31. – N. 4. – P. 231–233.
8. Kirkeby S., Moe D. //Immunol. Cell Biol. – 2001. – Vol. 79. – N. 2. – P. 121–127.
9. Луцик А. Д., Детюк Е. С. //Архив АГЭ. – 1987. – Т. 92. – N. 6. – С. 74–89.
10. Graham R. C., Karnovsky M. J. //J. Histochem. Cytochem. – 1966. – Vol. 14. – N. 4. – P. 291–301.
11. Stucky C. L., Lewin G. R. //J. Neurosci. – 1999. – Vol. 19. – N. 15. – P. 6497–6505.
12. Tanaka Y., Yoshida Y., Hirano M. //J. Laryngol. Otol. – 1993. – Vol. 107.– N. 10. – P. 916–919.
13. Wang H. F., Shortland P., Park M. J., Grant G. //Neuroscience. – 1998. – Vol. 87. – N. 1. – P. 275–288.

The purpose of the present research consist in comparison of character and differences of allocation to receptors lectins Ricini Communis–I and lectin Viscum album between structural components of sensitive ganglions at whites rats. By objects of research were the ganglion nodose nervus vagus.and ganglion trigeminus. Histochemical revealing of receptors to lectins effected according to the references Lucik A. D., Detuk E. C. (1978). The received morphological preparations were exposed to a method of computer videoanalysis. The metric and optical parameters were analyzed. The findings of investigation demonstrates changes of structure and topography glycoconjugates in various afferent units. Fixed, that the application lectins as histochemical reagents in a combination to a method of computer videoanalysis of the images allows effectively to carry out selective histochemical markers of separate phylums and populations of cells.

Кафедра общественного здоровья и организации здравоохранения Ярославская государственная медицинская академия

Поступила в редакцию 25.11.2002.